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膜表达型InsB15-23和IGRP206-214H-2Kd单链三聚体真核表达载体对NOD小鼠I型糖尿病的影响

作　者: 陈则东
导　师: 季明春
学　校: 扬州大学
专　业: 动物学
关键词: Ⅰ型糖尿病 NOD小鼠 细胞毒T细胞 抗原表位 H-2K~d单链三聚体
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


I型糖尿病(TID)是一种器官特异性自身免疫性疾病。在疾病的发生和发展过程中会出现多种自身抗原,包括胰岛素(Ins)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、葡萄糖-6-磷酸催化亚基相关蛋白(IGRP)等,其中有些抗原表位在疾病的进程中扮演着重要的角色,如InsB15-23-GAD65p90、IGRP206-214,而且它们之间还存在抗原表位扩展的现象。在I型糖尿病进程中,InsB15-23特异性CTL被认为是起始的抗原表位特异性CTL,对于其他抗原表位的暴露及相应CTL的诱导起到了关键性作用；葡萄糖-6-磷酸催化亚基相关蛋白(IGRP)是多种膜系统的组成成分,有报道发现采用毒素偶联的四聚体选择性清除IGRP206-214特异性CTL,能够显著性延迟NOD小鼠I型糖尿病的发生。因此本研究选取InsB15-23、IGRP206-214做为研究对象,分别观察mInsB15-23H-2KdSCT、mIGRP206-214H-2KdSCT两种膜表达型单链三聚体对NOD小鼠I型糖尿病进程的影响。我们首先以本实验室前期构建的mInsB15-23H-2KdSCT真核表达载体为基础,进一步构建mIGRP206-214H-2KdSCT真核表达载体,然后用mInsB15-23H-2KdSCT真核表达载体转染K562细胞,用H-2Kd的抗体作为一抗,通过免疫荧光法确定mInsB15-23H-2KdSCT能够在真核细胞内表达并定位在细胞膜上。采用mInsB15-23H-2KdSCT和mIGRP206-214H-2KdSCT两种真核表达载体分别给3周龄、7周龄的NOD母鼠皮下注射,以皮下注射pCDNA3.1(-)真核表达载体组小鼠作为实验对照,发现mInsB15-23-H-2KdSCT组与对照组相比,NOD小鼠的动态血糖、30周龄时平均血糖和发病率均比对照组低,表明mInsB15-23-H-2KdSCT具有显著延迟NOD小鼠血糖升高的趋势,而mIGRP206-214-H-2Kd-SCT组与对照组相比,NOD小鼠的动态血糖、30周龄时平均血糖和发病率均比对照组高,表明mIGRP206-214H-2KdSCT没有延迟NOD小鼠血糖升高的趋势。为了探索mInsB15-23H-2KdSCT和mIGRP206-214H-2KdSCT延迟NOD小鼠血糖升高的机制,我们试图制备相关H-2Kd四聚体,用于检测NOD小鼠体内特异性CTL的变化。我们以本实验室前期制备的pET22b-InsB15-23-β-2m-H-2-Kd为基础,通过基因工程的方法成功地构建了pET22b-IGRP206-214-β2m-H-2-Kd原核表达载体。通过包涵体的洗涤、蛋白纯化、复性、超滤、截留、交换buffer、生物素化、去游离生物素、然后将将纯化蛋白与一定量PE标记的链酶亲和素共孵育,成功制备PE标记的IGRP206-214四聚体(IGRP206-214-Tetramer-PE)。选用NOD小鼠作为实验对象,以BALB/c小鼠作为阴性对照,发现NOD小鼠IGRP206-214-Tetramer+、CD8+双阳性细胞高于对照组,且存在统计学的差异,证明我们制备的此四聚体能够用于IGRP206-214特异性CTL的检测。我们使用mInsB15-23H-2KdSCT真核表达载体在NOD小鼠3周龄时进行皮下接种、mIGRP206-214H-2KdSCT真核表达载体在NOD小鼠7周龄时进行皮下接种,利用自制的IGRP206-214-Tetramer分析其对外周血IGRP206-214特异性CTL的影响。结果显示过表达mInsB15-23H-2KdSCT的NOD小鼠在16、40周龄时外周血IGRP206-214特异性CTL比例有降低的趋势,但与对照组相比无统计学差异；由于时间的限制,我们没有在最佳的时间点(8周、10周、12周)进行监测,因此过表达mIGRP206-214H-2KdSCT能否降低IGRP206-214特异性CTL频率尚无法判断；而接种了mIGRP206-214H-2KdSCT真核表达载体的NOD小鼠外周血IGRP206-214特异性CTL频率与对照组相比经历了增高、又趋于相同的变化过程,表明mIGRP206-214H-2KdSCT可能具有诱导IGRP206-214特异性CTL增殖的功能。全文表明针对疾病早期暴露的抗原(Ins),过表达mInsB15-23H-2Kd-SCT可以显著降低NOD小鼠T1D的发病率；但是尚无法判断其能否降低NOD小鼠IGRP206-214特异性CTL数量；针对疾病中后期暴露的抗原(IGRP),尽管过表达mIGRP206-214H-2Kd-SCT能增加NOD小鼠IGRP206-214特异性CTL频率,表现出稍微增高NOD小鼠TID的发病率；总的来说,对TID影响不大；

全文目录


中文摘要  2-4
Abstract  4-7
符号说明  7-9
第一部分 mIGRP_(206-214)H-2K~dSCT真核表达载体的构建及膜定位的鉴定  9-19
  1 材料  9-12
  2 方法  12-16
  3 实验结果  16-18
  4 讨论  18
  参考文献  18-19
第二部分 过表达mInsB_(15-23)H-2K~dSCT、mIGRP_(206-214)H-2K~dSCT对NOD小鼠糖尿病进程的影响  19-27
  1 材料  19-20
  2 方法  20-21
  3 实验结果  21-23
  4 讨论  23-25
  参考文献  25-27
第三部分 过表达mInsB_(15-23)H-2K~dSCT、mIGRP_(206-214)H-2K~dSCT对NOD小鼠体内IGRP_(206-214)特异性CTL频率的影响  27-59
  1 材料  27-34
  2 方法  34-46
  3 实验结果  46-55
  4 讨论  55-57
  5 全文结论  57
  参考文献  57-59
附录  59-60
综述  60-70
  参考文献  66-70
致谢  70-71

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病
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