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HIV-1 Vpr激活细胞NF-κB信号通路分子机制的研究

作　者: 刘瑞康
导　师: 耿运琪
学　校: 南开大学
专　业: 微生物学
关键词: 病毒蛋白R NF-κB信号通路 IKK TAK1蛋白磷酸化
分类号: R512.91
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

Vpr是由人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)编码的辅助蛋白。Vpr蛋白在病毒感染晚期表达,通过与Gagp6直接相互作用被包装到病毒颗粒中。Vpr在HIV-1复制及致病性等方面发挥重要作用,特别是能够在病毒感染早期改变细胞环境,使之有利于病毒复制。vpr基因的缺失会导致病毒复制能力显著下降。Vpr具有多种功能,包括可调节细胞NF-κB在内的多条信号通路,但Vpr对NF-κB信号通路的确切作用及其中的分子机制尚不明确。本文对Vpr与NF-κB信号通路的关系展开研究,获得相关实验数据如下：1.证实Vpr可同时激活NF-kB经典和非经典信号通路：发现在HIV-1感染早期,病毒颗粒包装的Vpr能增强IκBα的磷酸化；同时,Vpr可以促进p65磷酸化及入核并最终激活NF-κB报告基因；过表达Vpr及病毒颗粒携带的Vpr均能引起p100的磷酸化,促进p100剪切为p52,从而活化非经典通路。2.Vpr与NF-κB经典和非经典信号通路上游的IKKα和IKKβ存在相互作用,并调节二者的磷酸化；利用RNA干扰技术下调细胞内源p65、RelB、IKKα及IKKP的表达,发现Vpr对NF-κB信号通路的激活作用明显减弱。3.通过免疫共沉淀实验对IKK复合物上游关键调节因子的筛选,发现Vpr与TRAF6及TAK1在体内存在相互作用,不与TRAF2及TAB1相互作用。但Vpr并不能影响TRAF6的自身泛素化。过表达和病毒感染两个层面均证实Vpr可在多种细胞中增强TAK1第187位苏氨酸(Thr187)的磷酸化,导致底物蛋白IKKα、IKKβ及MKK7的磷酸化,进而活化下游信号通路；同时,Vpr对TAK1的磷酸化依赖于TAB1及TRAF6;此外,Vpr通过募集TAB3促进TAK1的泛素化。4.对Vpr活化NF-κB信号通路后对自身功能的影响进行初探：在NF-κB信号通路关键蛋白下调的细胞系中,检测Vpr对HIV-1LTR的激活作用,结果表明,Vpr介导的NF-κB活化促进了其对LTR的激活作用；进一步通过流式细胞术分析了Vpr在这些细胞系中诱导细胞周期G2/M期停滞的能力,初步证明NF-κB信号通路的激活有助于Vpr行使细胞周期停滞功能。综上所述,本文证实了HIV-1感染宿主细胞早期,Vpr能够激活细胞内NF-κB经典和非经典信号通路,并初步阐明其中的分子机制：Vpr一方面通过增强IKKα及IKKβ的磷酸化,另一方面通过结合并增强TAK1的活性,共同实现了“劫持”NF-κB信号通路的目的,并促进自身LTR的转录、引起细胞周期停滞在G2/M期,从而有利于病毒的复制。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-15
第一章引言  15-55
  第一节人类免疫缺陷病毒(HIV)简介  15-25
    1.1.1 HIV-1病毒颗粒概况  15-16
    1.1.2 HIV-1基因组结构及其功能  16-21
      1.1.2.1 长末端重复序列LTR  17
      1.1.2.2 结构基因及其产物  17-18
      1.1.2.3 调控基因及其产物  18-19
      1.1.2.4 辅助基因及其产物  19-21
    1.1.3 HIV-1基因表达调控  21-25
      1.1.3.1 宿主转录因子的调节  21-22
      1.1.3.2 细胞因子的调节  22-23
      1.1.3.3 自身编码蛋白的调节  23
      1.1.3.4 超感染病毒蛋白的调节  23
      1.1.3.5 表观遗传的调节  23-25
  第二节 Vpr蛋白研究进展  25-31
    1.2.1 Vpr蛋白概述  25
    1.2.2 Vpr蛋白的结构  25-26
    1.2.3 Vpr蛋白的功能  26-31
      1.2.3.1 诱导细胞周期G_2/M期停滞  27-29
      1.2.3.2 反式激活HIV-1 LTR及宿主基因的表达  29-30
      1.2.3.3 诱发细胞凋亡  30
      1.2.3.4 促进反转录过程的保真性  30-31
      1.2.3.5 促进前整合复合物入核  31
  第三节 NF-κB信号通路  31-46
    1.3.1 NF-κB信号通路的组成  32-35
      1.3.1.1 NF-κB因子  32-33
      1.3.1.2 IκB(NF-κB抑制蛋白)  33-34
      1.3.1.3 IKK(IκB kinase)  34-35
    1.3.2 NF-κB信号通路简介  35-39
      1.3.2.1 NF-κB经典通路  37
      1.3.2.2 NF-κB非经典通路  37-38
      1.3.2.3 NF-κB信号通路的负调节  38-39
    1.3.3 病毒与NF-κB信号通路的关系  39-46
      1.3.3.1 病毒激活NF-κB信号通路  40-43
      1.3.3.2 病毒抑制NF-κB信号通路  43-46
  第四节 AP-1信号通路  46-50
    1.4.1 转录因子AP-1  46-47
    1.4.2 AP-1信号通路简介  47-49
    1.4.3 病毒与AP-1信号通路的关系  49-50
  第五节 TAK1蛋白  50-53
    1.5.1 TAK1简介  50-51
    1.5.2 TAK1活性的调节  51-52
      1.5.2.1 TAK1的磷酸化  51-52
      1.5.2.2 TAK1的泛素化  52
      1.5.2.3 TAK1活性的负调节  52
    1.5.3 病毒与TAK1的关系  52-53
  第六节本研究的目的和意义  53-55
第二章材料与方法  55-79
  第一节实验材料  55-62
    2.1.1 细胞  55
    2.1.2 菌株  55-56
    2.1.3 质粒  56-61
      2.1.3.1 本文构建的质粒  56-59
      2.1.3.2 本文用到的其他质粒  59-61
    2.1.4 药物  61
    2.1.5 主要试剂  61-62
      2.1.5.1 克隆操作所用酶类及试剂  61
      2.1.5.2 抗体  61
      2.1.5.3 其他试剂  61-62
  第二节实验方法  62-79
    2.2.1 基因操作  62-69
      2.2.1.1 引物设计及合成  62-67
      2.2.1.2 聚合酶链式反应(PCR)  67-68
      2.2.1.3 DNA的酶切和连接  68
      2.2.1.4 E.coli感受态细胞的制备和转化  68
      2.2.1.5 质粒DNA提取  68-69
      2.2.1.6 测序  69
    2.2.2 蛋白表达和包涵体分离  69
    2.2.3 多克隆抗体制备及效价测定  69-70
      2.2.3.1 免疫小鼠  69-70
      2.2.3.2 抗体效价测定  70
      2.2.3.3 抗血清收集  70
    2.2.4 细胞相关实验  70-71
      2.2.4.1 细胞培养  70-71
      2.2.4.2 细胞转染  71
      2.2.4.3 THP-1的诱导分化  71
    2.2.5 荧光素酶活性测定(Luciferase assay)  71-72
    2.2.6 免疫印迹(Western Blotting)  72-73
      2.2.6.1 细胞裂解液制备  72
      2.2.6.2 SDS-PAGE  72-73
      2.2.6.3 转膜  73
      2.2.6.4 杂交  73
    2.2.7 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,co-IP)  73-74
    2.2.8 免疫荧光分析(Immunofluorescence assay,IFA)  74-75
      2.2.8.1 IFA相关试剂  74-75
      2.2.8.2 IFA实验步骤  75
    2.2.9 流式细胞术(Fluorescence-Activated Cell Sorting,FACS)  75-76
    2.2.10 RNA干扰实验(RNAi)  76-77
      2.2.10.1 RNAi质粒的构建  76
      2.2.10.2 shRNA反转录病毒的包装  76
      2.2.10.3 稳定表达shRNA细胞系的构建  76-77
    2.2.11 病毒相关实验  77-78
      2.2.11.1 反转录病毒颗粒的制备  77
      2.2.11.2 HIV-1 p24抗原的检测  77-78
      2.2.11.3 病毒感染  78
    2.2.12 统计学分析  78-79
第三章结果与分析  79-120
  第一节 HIV-1 Vpr通过IKKα及IKKβ激活NF-κB信号通路  79-96
    3.1.1 HIV-1 Vpr激活细胞NF-κB经典通路  79-87
      3.1.1.1 Vpr能够激活NF-κB报告基因  79-81
      3.1.1.2 病毒颗粒携带的Vpr增强IκBα的磷酸化  81-83
      3.1.1.3 过表达Vpr引起IκBα的磷酸化  83-84
      3.1.1.4 Vpr促进p65的磷酸化及入核  84-86
      3.1.1.5 Vpr活化NF-κB信号通路需要p65的参与  86-87
    3.1.2 Vpr能够激活NF-κB非经典通路  87-92
      3.1.2.1 Vpr增强p100磷酸化  87-90
      3.1.2.2 Vpr促进p100的剪切  90-91
      3.1.2.3 Vpr活化NF-κB信号通路依赖细胞内源的RelB  91-92
    3.1.3 Vpr与IKKα和IKKβ存在相互作用并调节其激酶活性  92-96
      3.1.3.1 Vpr与IKKα和IKKβ存在相互作用  92-93
      3.1.3.2 Vpr增强IKKα和IKKβ的磷酸化  93-95
      3.1.3.3 IKKα和IKKβ是Vpr激活NF-κB信号通路的关键  95-96
  第二节 HIV-1 Vpr通过调节TAK1的活性激活NF-κB信号通路  96-114
    3.2.1 Vpr增强TAK1的磷酸化  96-108
      3.2.1.1 Vpr能激活AP-1报告基因  96-97
      3.2.1.2 Vpr促进TAK1 Thr187的磷酸化  97-101
      3.2.1.3 Vpr激活NF-κB/AP-1信号通路需要TAK1的磷酸化  101-103
      3.2.1.4 Vpr与TAK1而非TAB1存在相互作用  103-106
      3.2.1.5 Vpr对TAK1的磷酸化依赖于TAB1  106-108
    3.2.2 Vpr参与调节TAK1泛素化的初步研究  108-114
      3.2.2.1 Vpr增强TAK1的泛素化  108
      3.2.2.2 Vpr与TRAF6而非TRAF2相互作用  108-110
      3.2.2.3 Vpr不影响TRAF6的自身泛素化  110-111
      3.2.2.4 Vpr对TAK1的磷酸化依赖于TRAF6  111-112
      3.2.2.5 Vpr增强TAB3与TAK1的结合  112-113
      3.2.2.6 Vpr磷酸化TAK1需要TAK1被泛素化  113-114
  第三节 Vpr激活NF-κB信号通路对自身功能的影响  114-120
    3.3.1 Vpr点突变激活NF-κB及HIV-1 LTR的能力  114-115
    3.3.2 Vpr激活HIV-1 LTR依赖于NF-κB信号通路  115-116
    3.3.3 Vpr点突变诱导细胞周期G_2/M期停滞的能力  116-117
    3.3.4 NF-κB信号通路的活化对Vpr行使细胞周期停滞功能的影响  117-120
第四章讨论  120-127
  第一节 Vpr可在病毒感染早期激活NF-κB信号通路  120-121
  第二节 Vpr通过调节IKK复合物的活性激活NF-κB信号通路  121-122
  第三节 Vpr可调节TAK1的活性  122-124
  第四节 Vpr介导NF-κB信号通路活化的效应  124-127
    4.4.1 Vpr活化NF-κB信号通路对病毒复制的影响  124-125
    4.4.2 Vpr活化NF-κB信号通路对细胞的影响  125-127
第五章结论与展望  127-130
  第一节结论  127-129
  第二节展望  129-130
参考文献  130-148
致谢  148-150
附录英文缩写  150-152
个人简历  152-153
在学期间发表的学术论文与研究成果  153

HIV-1 Vpr激活细胞NF-κB信号通路分子机制的研究

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