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微小RNA（miRNA）调控乙型（HBV）和丙型（HCV）肝炎病毒基因表达和复制的分子机制研究

作　者: 陈燕妮
导　师: 吴建国
学　校: 武汉大学
专　业: 微生物学
关键词: 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 病毒感染 miR-122 miR-21 免疫反应 治疗药物
分类号: R512.6
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


调控基因的表达和后续生成对人类病原体的持续和慢性感染至关重要,如乙型肝炎病毒(HBV),感染全球范围超过4亿人,是导致肝脏疾病的重要原因。在这项研究中,我们首次提供了一个肝脏特异的微小RNA, miR-122,通过碱基配对相互作用方式与一个高度保守的HBV前基因组RNA序列结合,抑制HBV基因表达和复制的直接证据。miR-122的靶序列同时也位于病毒聚合酶mRNA的编码区和核心蛋白mRNA的3,非编码区。培养的细胞中,miR-122表达量的增加导致HBV基因表达和复制的减少,而在HBV复制和感染存在的情况下,miR-122的表达减少。此外,对临床标本的分析表明在HBV阳性患者外周血单核细胞中,miR-122水平和病毒载量之间在体内呈负线性关系。我们的研究结果表明miR-122可通过和病毒靶序列的结合,下调HBV的复制,利于了解HBV持续/慢性感染,并且HBV导致的对miR-122表达的调控可能代表了促进病毒发病机理的机制。一旦病毒的成分被模式识别受体识别,包括Toll样受体(TLRs)和维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-I)样解旋酶,细胞被激活,产生I型干扰素(IFN)和炎性细胞因子。这些途径是受宿主严格调控的,以防止不适当的细胞反应,但病毒可以通过调节这些途径来进行扩散和蔓延。丙型肝炎病毒(HCV)感染引起大范围的慢性肝损伤,但HCV如何逃避免疫耐受系统的机制仍然不甚清晰。最近,细胞质RNA介导的抗病毒信号的负调控因子的识别,引起了足够的重视。在本研究中,我们发现,人肝细胞中,HCV病毒的感染上调微小RNA-21(miR-21)的表达,这反过来又抑制由HCV引发的Ⅰ型干扰素的产生,从而促进HCV的复制。此外,我们证明,TLR信号转导通路中的两个重要因子,髓样分化因子88(MyD88)和白细胞介素1受体相关激酶1(IRAK1),这两个参与HCV诱导I型干扰素的生产中的重要因子,为miR-21的靶标。总之,我们的研究结果表明,miR-21在HCV感染中上调并通过MyD88和IRAK1负向调控IFN-α信号,它可能是抗病毒药物的干预中的一个潜在的治疗靶标。

全文目录


中文摘要  7-9
Abstract  9-16
引言  16-18
第一部分 综述  18-66
  第一章 乙型肝炎病毒  19-30
    1.1 HBV的历史背景及其感染的流行病学简介  20
    1.2 HBV的病毒特征  20-23
    1.3 HBV的转录和复制  23-25
      1.3.1 HBV的转录  23-24
      1.3.2 HBV的复制  24-25
    1.4 HBV的免疫发病机理  25-26
    1.5 人类宿主中的HBV周期  26-28
    1.6 HBV的预防和治疗  28-30
      1.6.1 HBV的预防  28-29
      1.6.2 HBV的治疗  29-30
  第二章 丙型肝炎病毒  30-46
    2.1 HCV的结构和基因组  30-32
      2.1.1 HCV的结构  30-31
      2.1.2 HCV的基因组结构  31-32
    2.2 HCV的复制和生命周期  32-33
    2.3 HCV细胞内逃避免疫机制  33-46
      2.3.1 宿主对感染的反应  34-36
      2.3.2 HCV引起的宿主反应  36-37
      2.3.3 HCV调控和逃避宿主反应  37-39
      2.3.4 HCV调控干扰素通路  39-40
      2.3.5 HCV调控ISG的表达或功能  40-42
      2.3.6 病毒遗传变异和感染后的宿主反应  42-43
      2.3.7 miRNA及HCV感染  43-44
      2.3.8 HCV-宿主相互作用模型  44-46
  第三章 治疗肝癌的新方法：小分子RNA(miRNA)疗法  46-66
    3.1 miRNA和它们在病毒感染中的作用  47-48
    3.2 DNA病毒编码的miRNA  48-51
      3.2.1 疱疹病毒编码的miRNA  48-49
      3.2.2 埃博拉病毒编码的miRNA(EBV)  49-51
    3.3 miRNAs编码的其它DNA病毒  51-52
      3.3.1 猴肾病毒40(SV40)和其他多瘤病毒  51-52
      3.3.2 腺病毒编码的miRNA  52
    3.4 RNA病毒编码的miRNAs  52-53
    3.5 宿主miRNA及其同病毒感染的相互作用  53-55
      3.5.1 在病毒感染中起止面调节作用的miRNA  53-54
      3.5.2 在病毒感染中起负面调节作用的miRNA  54-55
    3.6 miRNA的肝脏生物学  55-66
      3.6.1 肝癌中的miRNA表达谱  56-57
      3.6.2 miRNA和病毒性肝炎  57-59
      3.6.3 肝特异性miRNA：miR-122在肝病中的特征  59-61
      3.6.4 肝癌中高表达miRNA：miR-21的特征  61-63
      3.6.5 miRNA可做为通用的抗癌治疗因子  63-66
第二部分 肝特异性miRNA和HBV的相互作用研究  66-118
  第四章 前言  66-68
  第五章 在人肝细胞中HBV下调miR-122的表达  68-79
    5.1 引言  68
    5.2 实验材料及仪器  68-70
      5.2.1 细胞  68
      5.2.2 实时定量(Real-Time)PCR检测引物  68
      5.2.3 工具酶  68
      5.2.4 其他生物试剂  68-69
      5.2.5 化学试剂和仪器  69-70
    5.3 实验方法  70-77
      5.3.1 哺乳动物细胞培养  70-71
      5.3.2 细胞系总RNA提取及Real-Time PCR反应  71-77
    5.4 实验结果及讨论  77-79
      5.4.1 HepG2.2.15细胞中miR-122表达水平明显低于HepG2细胞  77-78
      5.4.2 HepG2.2.15细胞和HepG2细胞miRNA芯片分析结果  78-79
  第六章 miR-122抑制HBV基因的表达和复制  79-96
    6.1 引言  79
    6.2 实验材料及仪器  79-81
      6.2.1 细菌菌种和质粒  79
      6.2.2 合成寡核苷酸  79
      6.2.3 哺乳动物细胞株/系  79-80
      6.2.4 细菌/细胞培养基  80
      6.2.5 化学试剂和实验仪器  80-81
      6.2.6 试剂盒和转染试剂  81
    6.3 实验方法  81-92
      6.3.1 哺乳动物细胞转染用高纯度质量的提取(Tiangen试剂盒为例)  81-83
      6.3.2 哺乳动物细胞的培养、复苏和冻存(见第五章)  83
      6.3.3 哺乳动物细胞的转染  83-84
      6.3.4 乙肝表面抗原(s),e抗原的检测  84-85
      6.3.5 Northern Blot检测HBV RNA水平  85-90
      6.3.6 HBV复制中间体(HBV capsid-associated viral DNA)荧光定量PCR检测  90-92
    6.4 实验结果及讨论  92-96
      6.4.1 通过转染合成寡核苷酸可调节细胞内miR-122的表达水平  92-93
      6.4.2 miR-122抑制HBV蛋白的表达  93-94
      6.4.3 miR-122可抑制HBV RNA的表达及DNA的复制  94-96
  第七章 HBV聚合酶为miR-122的靶mRNA编码基因  96-105
    7.1 引言  96
    7.2 实验材料及仪器  96-98
      7.2.1 细菌菌种和质粒  96-97
      7.2.2 哺乳动物细胞株/系  97
      7.2.3 构建所用引物：如表6.1所示  97
      7.2.4 工具酶、试剂盒及抗体  97
      7.2.5 其他生物试剂  97-98
      7.2.6 化学试剂和仪器  98
    7.3 实验方法  98-100
      7.3.1 哺乳动物细胞转染用高纯质粒提取(见第六章)  98
      7.3.2 哺乳动物的培养、复苏和冻存(见第六章)  98
      7.3.3 哺乳动物细胞的转染(见第六章)  98
      7.3.4 荧光素酶报告基因检测  98-99
      7.3.5 蛋白质免疫印迹(Western Blot)  99-100
    7.4 实验结果及讨论  100-105
      7.4.1 HBV聚合酶基因为miR-122的靶mRNA编码基因  100-103
      7.4.2 miR-122也通过类似的机制调控adw亚型的HBV基因表达和复制  103-105
  第八章 miR-122通过与HBV的靶RNA序列碱基配对的相互作用调控HBV感染  105-111
    8.1 引言  105
    8.2 实验材料及仪器  105-106
      8.2.1 细菌菌种和质粒  105
      8.2.2 哺乳动物细胞株/系  105
      8.2.3 构建所需引物及合成寡合甘酸：如表8.1所示  105-106
      8.2.4 试剂及仪器  106
    8.3 实验方法  106-107
      8.3.1 哺乳动物细胞转染用高纯质粒提取(见第六章)  106
      8.3.2 哺乳动物的培养、复苏和冻存(见第六章)  106
      8.3.3 哺乳动物细胞的转染(见第六章)  106
      8.3.4 乙肝表面抗原(s),e抗原的检测(见第六章)  106
      8.3.5 HBV复制中间体(HBV capsid-associated viral DNA)荧光定量PCR检测(见第六章)  106
      8.3.6 一步法突变构建HBV1.3倍体上miR-122靶标序列的相应特异性位点突变体  106-107
      8.3.7 Northern Blot检测HBV与miR-122的杂交  107
    8.4 实验结果和讨论  107-111
  第九章 体内HBV感染和miR-122表达水平的相关性研究  111-115
    9.1 引言  111
    9.2 实验材料及仪器  111
      9.2.1 临床标本  111
      9.2.2 试剂和仪器  111
    9.3 实验方法  111-113
      9.3.1 miRNA检测(见第五章)  111
      9.3.2 血样中外周血单核细胞(PBMC)的分离  111-112
      9.3.3 血样中HBV病毒载量的荧光定量PCR检测  112-113
    9.4 实验结果和讨论  113-115
  第十章 总论  115-118
第三部分 在癌症中普遍上调的miRNA和HCV的相互作用研究  118-147
  第十一章 前言  118-120
  第十二章 HCV的感染上调miR-21的表达  120-125
    12.1 引言  120
    12.2 实验材料及仪器  120-121
      12.2.1 细菌菌种,质粒和病毒  120
      12.2.2 哺乳动物细胞株/系  120
      12.2.3 试剂及仪器  120-121
    12.3 实验方法  121-123
      12.3.1 哺乳动物细胞转染用高纯质粒提取(见第六章)  121
      12.3.2 哺乳动物细胞的培养、复苏和冻存(见第六章)  121
      12.3.3 哺乳动物细胞的转染(见第六章)  121
      12.3.4 miRNA检测(见第五章)  121
      12.3.5 外周血淋巴细胞(PBMC)的分离和培养  121
      12.3.6 HCV的感染和保存  121
      12.3.7 pFL-J6/JFH-1的线性化,体外转录及转染  121-123
    12.4 实验结果及讨论  123-125
  第十三章 miR-21可抑制HCV触发的Ⅰ型干扰素产物的表达  125-135
    13.1 引言  125
    13.2 实验材料及仪器  125-126
      13.2.1 合成寡核苷酸和实验所需引物  125-126
      13.2.2 病毒,试剂盒和抗体  126
      13.2.3 其它材料和仪器  126
    13.3 实验方法  126-129
      13.3.1 细胞上清中IFN-α蛋白含量的ELISA检测  126-128
      13.3.2 半定量PCR检测  128-129
      13.3.3 其它实验方法  129
    13.4 实验结果及讨论  129-135
      13.4.1 在肝细胞内miR-21抑制HCV触发的Ⅰ型干扰素产物的合成  129-131
      13.4.2 miR-21通过拮抗HCV引起的IFN-α抗病毒反应促进HCV的复制  131-133
      13.4.3 miR-21的过表达可抑制IFN-α引起的抗病毒反应  133-135
  第十四章 MyD88和IRAK1为miR-21的靶标基因  135-144
    14.1 引言  135
    14.2 实验材料及仪器  135-137
      14.2.1 合成寡核苷酸及实验所需引物  135-136
      14.2.2 哺乳动物细胞  136
      14.2.3 质粒  136
      14.2.4 其它实验试剂及仪器  136-137
    14.3 实验方法  137
      14.3.1 3’UTR荧光素酶报告系统的构建  137
      14.3.2 流式细胞检测  137
      14.3.3 其它实验方法  137
    14.4 实验结果及讨论  137-144
      14.4.1 miR-21调节TLR-7信号级联通路中各组成成分的基因表达  137-139
      14.4.2 MyD88和IRAK1为miR-21的靶标  139-141
      14.4.3 miR-21对IFN信号通路的调控受MyD88和IRAK1介导  141-144
  第十五章 总论  144-147
参考文献  147-164
攻博期间发表和待发表的论文  164-165
致谢  165

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