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HIV-1 MPER表位分支肽免疫原免疫原性及其衍生多肽促感染活性的研究

作　者: 张丽双
导　师: 孔维
学　校: 吉林大学
专　业: 微生物学
关键词: HIV-1 近膜外区四分支肽广泛中和活性 HIV-1感染增强逆转录病毒基因转导
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

刺激保护性抗体应答是抗HIV-1疫苗研发的一个关键目标。在本论文中，我们开发了新型的包含gp41MPER表位分支肽免疫原，它们在豚鼠体内可以诱导产生针对HIV-1的广泛中和抗体。同时，基因转导效率是逆转录病毒载体基因治疗中的重要制约因素。因此，这里我们开发了新型的基于MPER的衍生多肽，能够有效增强逆转录病毒感染。1. HIV-1MPER特异性多肽免疫原的研究HIV-1包膜蛋白上的MPER是多种HIV-1广泛中和抗体（4E10,2F5, Z13, m66and10E8）的靶点，因此在疫苗研究中引发广泛关注。MPER在HIV-细胞膜融合过程中发挥重要作用，在此过程中MPER经历了一系列的构象变化，其间该区域短暂暴露，被免疫系统识别以产生广泛中和抗体应答。因此构建一种强力的MPER特异性的HIV-1疫苗的主要挑战是MPER的复杂并处于变化中的区域构象，而到目前为止，还没有这种构象变化的确定信息。2F5/4E10与线性表位多肽共结晶的结果显示，这两种抗体识别的核心表位构象分别是-turn和-helical二级结构，但是无论是构象严格限制的还是完全松弛的2F5/4E10表位免疫原，都不能诱导出广泛中和抗体应答。近些年来，只有极少数的几个MPER特异性疫苗诱导产生了很低的广泛中和活性，而MPER特异性的多肽免疫原还没有成功诱导广泛中和抗体的报道。本论文中，我们开发了2F5/4E10表位的MAP（分支肽）免疫原，内部没有添加化学键约束构象。我们假设MAP免疫原内部的表位单体之间的相互作用、赖氨酸核心的相对刚性结构和柔性的6-氨基己酸连接和表位尾巴能够赋予MAP免疫原一种刚柔动态平衡的结构，既不过分约束，又不过分松弛，希望能够达到诱导广泛中和抗体的目的。并且，MAP免疫原将多个表位汇聚在一个分支肽分子内，得到相对较高的分子量以诱导特异性抗体应答，同时可以避免蛋白或病毒载体疫苗引入很多无关表位。另外，多肽疫苗的合成和应用比蛋白或病毒载体疫苗更为简便。两种四分支肽4E10-MAP4和2F5-MAP4利用固相合成法合成；经过ELISA和吸附中和实验确认了四分支肽上2F5/4E10表位的正确性；油佐剂ADO-1调理后免疫豚鼠，通过ELISA终点法检测抗血清中gp41-特异性结合抗体的滴度(1104-105)；利用HIV-1假病毒中和实验确定了抗血清和纯化抗体具有针对HIV-1的广泛中和活性；最后通过ADCC实验测定4E10-和2F5-MAP4诱导产生微弱的ADCC效应。HIV-1假病毒中和实验结果显示，4E10-和2F5-MAP4都能诱导豚鼠产生针对HIV-1的广泛中和抗体，尽管强度不高。但是4E10-和2F5-KLH免疫原虽然都能诱导豚鼠产生高滴度的gp41特异性结合抗体，但是都不能诱导产生中和活性。一共检测了四种亚型内的十株假病毒。4E10-MAP4可以诱导产生针对BC(73%positive)、C (93%positive)、B (20%positive)和AE (30%positive)亚型的中和活性；而2F5-MAP4能诱导产生针对BC (100%positive)和B (10%positive)亚型的中和活性。同时检测豚鼠混合抗血清纯化IgG的中和结果，与单只豚鼠血清的中和结果相互佐证，基本一致。利用线性肽抑制4E10-和2F5-MAP4免疫抗血清IgG的中和活性结果，说明四分支肽免疫原免疫IgG能够识别类似于4E10/2F5表位的线性表位单体。总结来说，本论文中设计开发了两种新型MPER特异性MAP免疫原：4E10-和2F5-MAP4。二者均可以诱导豚鼠产生针对HIV-1的广泛中和抗体应答。虽然它们的强度显著弱于4E10和2F5抗体，但是它们是目前为止第一个成功诱导出HIV-1广泛中和抗体的MPER特异性合成肽免疫原，为更深入的开发研究奠定了基础。2. MPER衍生肽促感染活性的研究提高基因转导效率是逆转录病毒载体介导的基因治疗中的关键点。目前已经开发了很多种感染增强试剂，常用的有DEAE dextran、polybrene和protaminesulfate。近年来发现了几种淀粉样感染增强多肽，以其高效性和低毒性引发了研究人员的兴趣。其中包括两种精液衍生多肽SEVI (精液衍生感染增强因子，一种39个残基的多肽)和SEM、一种阿尔兹海默症相关的A肽和一种HIV-1gp120衍生多肽EF-C。SEVI研究最多，已经被证实可以增强逆转录基因传递效率。在这里，我们报道MPER衍生的13肽P13(Ac-NWFDITNWLWYIK-NH2；在上一章里叫做4E10-LP)和16肽P16(Ac-NWFDITNWLWYIK-KKK-NH2)具有显著的增强HIV-1感染的作用。P16介导的病毒感染增强作用适用于其他包膜病毒，并不局限于HIV-1。通过ThT结合实验和TEM观察，发现P13和P16具有类似于SEVI的淀粉样纤维结构，并且证实P16通过形成淀粉样纤维结构促进逆转录病毒感染。促感染试剂P16发挥最佳感染增强效果的条件是：1）低速震荡以获得成熟纤维；2）病毒颗粒与多肽在高浓度下预孵育使二者更好的形成复合物；3）感染缓冲液要尽量低离子强度和低于中性的pH条件；4）要在无血清条件下感染4h左右再补加血清或更换完全培养基。按照SEVI和一种典型的细胞穿膜肽Tat的原理，正电氨基酸，如Arg、His和Lys可以减弱病毒包膜和细胞膜之间的负电静电排斥，从而促进病毒和细胞的吸附，促进融合过程。P13(1,840Da; pI=7, charge=0)到P16(2,225Da;pI=10.48, charge=+3)的突变带来的感染增强活性的提高指向了正电氨基酸Lys的功能性贡献。接下来离子强度、pH值、阴离子多聚物抑制实验结果都证实了正电性在P16介导的促感染活性中的重要贡献。MPER是HIV-1gp41上一段高度保守和色氨酸富集的基序，拥有膜脂混合和扰动的特性，在病毒融合的过程中发挥重要作用。并且有文献表明，芳香性氨基酸利于淀粉样纤维的形成。因此这里我们把目光集中于芳香性氨基酸色氨酸，考察它对P16介导的促感染活性的作用。通过丙氨酸突变，得到的突变体促感染活性相较于P16明显下降，并且伴随了一定程度上的淀粉样纤维形成的减少。总结来说，P16介导的HIV-1感染增强作用可能是通过形成淀粉样纤维，无论可溶还是不可溶，形成一个支架或桥梁的结构。正电性的淀粉样纤维支架可以帮助负电性的病毒颗粒富集到靶细胞膜上，色氨酸的存在便于淀粉样纤维插入到细胞膜-水界面上，导致病毒感染效率的提高。我们对于淀粉样纤维形成、正电性和芳香性色氨酸对多肽促感染活性的贡献的研究，对于开发更有效的基因转导增强因子可能会有一定的帮助和指导。特别是，P16的促感染活性比常用的促感染试剂更强，如DEAE dextran、polybrene和SEVI，提示了其在逆转录病毒感染和基因治疗研究的预期应用。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-16
第一章 HIV-1 MPER 表位分支肽免疫原的研究  16-62
  第一节背景知识  16-30
    1.1 HIV 病毒简介  16-17
    1.2 HIV 疫苗研究现状  17-20
    1.3 HIV 广泛中和抗体  20-27
    1.4 分支肽疫苗、豚鼠实验动物  27-28
    1.5 立题依据及设计  28-30
  第二节四分支肽免疫原表位表征  30-36
    一. 实验材料  30-31
      1.1 Tricine SDS-PAGE 凝胶电泳  30-31
    二. 实验方法  31-32
      2.1 高效液相色谱（HPLC）  31
      2.2 质谱（MS）  31
      2.3 Tricine SDS-PAGE 电泳  31-32
      2.4 吸附中和实验  32
    三. 实验结果  32-36
      3.1 确定多肽的纯度和分子量  32-34
      3.2 分子水平验证多肽免疫原表位正确性  34-35
      3.3 细胞水平上确认多肽免疫原表位正确性  35-36
  第三节 MPER 表位多肽免疫原和免疫策略的探索  36-47
    一. 实验材料  36-40
      1.1 主要试剂  36-38
      1.2 试剂配方  38
      1.3 多肽  38-39
      1.4 质粒、病毒及细胞系  39-40
      1.5 实验动物  40
    二. 实验方法  40-43
      2.1 动物免疫  40
      2.2 动物采血  40-41
      2.3 ELISA 检测  41
      2.4 HIV-1 假病毒包装  41
      2.5 HIV-1 假病毒的滴度测定  41-42
      2.6 HIV-1 假病毒中和实验  42-43
      2.7 统计学处理方法  43
    三. 实验结果  43-47
      3.1 免疫原的选择  43-44
      3.2 免疫佐剂的选择  44-45
      3.3 免疫剂量的考察  45-47
  第四节四分支肽免疫原免疫原性表征  47-59
    一. 实验材料  47
      1.1 Protein A 纯化抗体柱的相关试剂  47
      1.2 ADCC 相关试剂  47
    二. 实验方法  47-50
      2.1 抗体分型  47-48
      2.2 抗体纯化  48
      2.3 ADCC  48-49
      2.4 线性表位多肽抑制四分支肽抗血清纯化 IgG 中和活性实验  49-50
    三. 实验结果  50-59
      3.1 四分支肽免疫原诱导抗血清的特异性结合活性  50-51
      3.2 豚鼠单只血清中和实验结果  51-54
      3.3 ADCC 活性  54-55
      3.4 抗血清纯化后得到的 IgG 的免疫原性和中和活性  55-57
      3.5 四分支肽免疫原诱导出的 HIV-1 中和抗体识别线性表位  57-58
      3.6 数据统计  58-59
  讨论  59-60
  小结  60-62
第二章 MPER 衍生多肽的促感染活性的研究  62-104
  第一节背景知识  62-68
    1.1 逆转录病毒载体在基因治疗中的重要地位  62-63
    1.2 人及 HIV 病毒来源的多肽对于 HIV 感染的促进作用  63-64
    1.3 HIV 包膜蛋白和 MPER  64
    1.4 淀粉样纤维及其促进病毒感染的研究  64-66
    1.5 立体依据和设计  66-68
  第二节 MPER 衍生肽促感染活性的发现和确认  68-93
    一. 材料、试剂和仪器  68-70
      1.1 多肽合成  68
      1.2 细胞、病毒和单克隆抗体  68-69
      1.3 主要试剂和材料  69
      1.4 试剂配制  69-70
      1.5 主要仪器与设备  70
    二. 实验方法  70-78
      2.1 多肽配制  70
      2.2 硫磺素 T (ThT) 结合实验  70-71
      2.3 透射电镜 (TEM)  71
      2.4 细胞杀伤实验（MTT）  71
      2.5 病毒包装  71-73
      2.6 HIV-1 感染实验  73-77
      2.7 血凝实验  77-78
    三. 实验结果  78-93
      3.1 4E10-LP（P13）促感染活性的发现  78-79
      3.2 以 P13 为基础的分子改造  79-80
      3.3 P16 促感染作用的特征  80-89
      3.4 P16 与常用促感染试剂的活性比较  89-90
      3.5 P16 促感染活性并不局限于 HIV-1 包膜病毒  90-93
  第三节 P16 促感染活性的机理研究  93-100
    一. 实验材料  93-94
      1.1 多肽  93
      1.2 试剂配制  93-94
    二. 实验方法  94-95
      2.1 Zeta 电位测定  94
      2.2 不同磷酸盐缓冲液条件下 P16 促感染情况考察实验  94
      2.3 阴离子多聚物肝素抑制 P16 介导的 HIV-1 感染增强作用实验  94-95
    三. 实验结果  95-100
      3.1 正电氨基酸对于 P16 促感染活性的影响  95-98
      3.2 芳香性氨基酸 Trp 对于 P16 促感染活性的影响  98-100
  讨论  100-102
  小结  102-104
结论  104-106
参考文献  106-123
作者简历  123-124
致谢  124

HIV-1 MPER表位分支肽免疫原免疫原性及其衍生多肽促感染活性的研究

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