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钙稳态系统在白念珠菌形态发生及压力应答中的功能研究

作　者: 喻其林
导　师: 李明春
学　校: 南开大学
专　业: 微生物学
关键词: 白念珠菌 钙稳态系统 形态发生 压力应答 钙泵 内质网压力 钙通道 极性生长 钙通道阻断剂
分类号: R379.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


白念珠菌是临床常见的条件性致病真菌之一。由于重症特护人群、免疫缺陷人群的增加及抗生素的滥用,白念珠菌感染,尤其是白念珠菌侵袭性感染备受人们关注。白念珠菌是一种典型的两型性真菌,具有菌丝发育、生物被膜形成等形态发生能力,这些能力与该真菌的形态发生调控网络及分泌途径具有密切联系。不仅如此,白念珠菌还具有极为精细的环境压力应答系统,用以感应抗真菌药物、氧化胁迫、营养匮乏等诸多环境压力,并对其作用应答,使自身得以存活与生长。白念珠菌的形态发生与压力应答能力均是白念珠菌在宿主体内进行有效定殖并造成感染所必需的,而这些能力又与白念珠菌钙稳态系统的功能紧密相关。内质网与液泡是白念珠菌细胞两种极为重要的细胞器。前者是细胞分泌途径的核心,同时也是介导压力应答的主要细胞器。后者是白念珠菌细胞最主要的钙库,在调控细胞钙稳态方面扮演着重要角色。尽管白念珠菌钙稳态系统中的许多成员已为人们所知,但维持内质网功能所必需的钙泵尚未得到鉴定,且液泡钙通道Yvc1的功能仍属未知。此外,尽管人们已明确白念珠菌钙通道在形态发生及压力应答过程中发挥重要功能,但目前尚无有效抑制钙通道活性,进而指导临床实践的报道。本研究针对以上三个重要问题,对白念珠菌内质网钙泵进行鉴定及功能分析,并对液泡钙通道Yvc1的功能进行探索,同时研究钙通道阻断剂对白念珠菌形态发生及压力应答的影响,以期发现白念珠菌的新型毒力相关因子,并为临床治疗白念珠菌感染提供新的参考。本研究的主要结果如下：(1)通过BLASTP分析,从白念珠菌基因组数据库中鉴定出一种内质网钙泵Spfl。序列比对分析发现,该蛋白属于V型P-ATPase家族成员。采用镍柱纯化技术,纯化得到Spfl蛋白,酶活分析发现该蛋白具有ATPase活性。通过对SPF1缺失菌株spf1△／△的研究发现,spf1△／△在正常生长条件下的生长速率明显降低,菌丝发育能力明显减弱,生物被膜形成、絮凝、粘附等能力显著下降,对抗真菌药物、低钙、高钙、氧化胁迫、碱性pH及膜损伤等诸多环境压力高度敏感,并且丧失了系统性感染小鼠的能力。上述结果表明,Spfl作为白念珠菌的内质网钙泵,在白念珠菌正常生长、形态发生及压力应答方面发挥着重要作用,是白念珠菌一种重要的毒力相关因子。(2)采用fluo-3荧光探针法及原子吸收分光光度法,分析SPF1缺失对白念珠菌胞质钙及总钙含量的影响,发现其缺失导致压力条件下白念珠菌细胞钙稳态的严重紊乱,证明Spfl在维持细胞钙稳态方面扮演着重要角色。通过Western blotting及内切糖苷酶(EndoH)分析,发现SPF1缺失导致N-糖基化蛋白Cdc101及分泌型酸性磷酸酶(SAP)糖基化的缺陷,表明Spfl在维持内质网功能,尤其是其糖基化功能方面发挥作用。通过细胞壁压力敏感性测定,细胞壁重构及组分分析,发现SPFl缺失导致白念珠菌对细胞壁压力的敏感性增强,细胞壁重构能力降低以及细胞壁组成异常,揭示了Spfl在细胞壁完整性(CWI)维持方面的重要功能。β-半乳糖苷酶分析及RT-PCR结果表明,SPFl缺失影响白念珠菌诸多基因的表达,主要表现在钙应答基因CCH1,CWI基因PGA13、ECM331、 DFG5及氧化应答基因OYE32的表达显著上调,以及内质网功能必需基因SEC61,形态发生相关基因HWP1、ALS3及ECE1的表达显著下调。上述结果揭示了白念珠菌钙稳态系统、内质网压力应答系统与形态发生调控网络间存在紧密联系。(3)液体培养及点板实验表明,yvc1Δ/Δ菌株表现为对低钙、高钙、碱性pH、氧化胁迫等诸多环境压力的敏感性增强；通过流式细胞技术,发现碱性刺激下yvc1Δ/Δ丧失了第二次钙波动的能力,而在高渗刺激下完全丧失钙波动的能力；在氧化胁迫条件下,yvc1Δ/Δ菌株的ROS水平显著偏高,抗氧化酶SOD与CAT的活性及氧化应答基因表达量均显著偏低。在形态发生方面,yvc1Δ/Δ菌株的菌丝发育、絮凝、侵染式生长、生物被膜形成等诸多形态发生能力均明显下降,形态发生相关基因的表达量显著下调。首次采用FM4-64及fluo-3对白念珠菌菌丝顶端液泡、顶体及胞质钙进行共染色,发现yvc1Δ/Δ菌丝顶端不存在液泡、顶体以及高钙梯度,表明Yvc1所介导的液泡钙释放在白念珠菌形态发生中发挥重要作用,而且这种作用与形态发生相关基因的表达以及极性生长有关。系统性感染及上皮细胞侵染实验表明,yvc1Δ/Δ菌株系统性感染小鼠的能力,以及侵染、损伤宿主上皮细胞及菌丝重新定向能力均显著下降。上述结果表明,Yvc1介导的液泡钙释放在白念珠菌压力应答及形态发生过程中发挥重要作用。(4)采用酶标仪对fluo-3荧光信号进行动力学扫描,发现钙通道阻断剂维拉帕米(verapamil)能够明显抑制碱性刺激及药物刺激下白念珠菌的钙波动,而硝苯地平(nifedipine)同样明显抑制碱性刺激引起的钙波动,但对药物刺激下的钙内流不具有抑制作用。采用棋盘法(Chequerboard test)测定钙通道阻断剂与抗真菌药物对白念珠菌生长的协同抑制作用,发现verapamil与抗真菌药物氟康唑(fluconazole)、衣霉素(tunicamycin)具有协同作用,说明verapamil能够降低白念珠菌耐受抗真菌药物的能力,而nifedipine不具有该增强效应。在形态发生方面,verapamil能够明显抑制白念珠菌菌丝及生物被膜发育,并且能够增强抗真菌药物对生物被膜形成与维持的抑制作用。RT-PCR分析表明,verapamil的单独处理或与抗真菌药物联用能显著抑制ALS3基因的表达。上述结果揭示了verapamil对白念珠菌压力应答及形态发生的抑制作用,为临床白念珠菌感染的治疗提供了参考。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-18
第一章 前言  18-45
  第一节 白念珠菌的生物学特性与流行病学  18-21
    1.1.1 白念珠菌的生物学特性  18-20
    1.1.2 白念珠菌的流行病学  20-21
  第二节 白念珠菌的形态发生  21-28
    1.2.1 白念珠菌形态发生概述  21-22
    1.2.2 白念珠菌两型性转换及其调节机制  22-28
  第三节 酿酒酵母及白念珠菌的压力应答机制  28-34
    1.3.1 CCS途径  29-31
    1.3.2 ERAD途径  31
    1.3.3 UPR途径  31-32
    1.3.4 SSR途径  32-33
    1.3.5 CWI型MAPK途径  33-34
    1.3.6 Hog1途径  34
  第四节 白念珠菌的钙信号系统  34-40
    1.4.1 白念珠菌的钙稳态系统  35-38
    1.4.2 白念珠菌的钙信号途径  38-40
  第五节 选题依据与技术路线  40-45
    1.5.1 选题依据与研究意义  40-43
    1.5.2 技术路线  43-45
第二章 内质网钙泵Spf1在白念珠菌形态发生及压力应答过程中的功能  45-93
  第一节 实验材料  46-54
    2.1.1 菌株、质粒与引物  46-48
    2.1.2 主要仪器  48
    2.1.3 主要试剂  48-52
    2.1.4 培养基  52-54
  第二节 实验方法  54-66
    2.2.1 白念珠菌的转化  54-55
    2.2.2 大肠杆菌的CaCl_2法转化  55
    2.2.3 大肠杆菌质粒的提取  55-56
    2.2.4 白念珠菌及酿酒酵母基因组的提取  56
    2.2.5 白念珠菌Spf1蛋白C端的标记  56-57
    2.2.6 白念珠菌SPF1基因的敲除  57-58
    2.2.7 Southern blotting  58-60
    2.2.8 白念珠菌总蛋白的提取  60
    2.2.9 Spf1蛋白的提取、纯化与检测  60-61
    2.2.10 ATPase活性分析  61
    2.2.11 Western blotting  61-62
    2.2.12 白念珠菌生长曲线的测定  62
    2.2.13 白念珠菌菌丝诱导  62
    2.2.14 白念珠菌絮凝能力测定  62-63
    2.2.15 白念珠菌粘附能力测定  63
    2.2.16 白念珠菌生物被膜形成能力测定  63-64
    2.2.17 白念珠菌敏感性测定  64-65
    2.2.18 白念珠菌毒力分析  65-66
  第三节 结果与分析  66-87
    2.3.1 白念珠菌钙泵Spf1的鉴定  66-68
    2.3.2 Spf1蛋白的纯化及酶学特性  68-70
    2.3.3 白念珠菌SPF1基因敲除菌株及其回补株的构建  70-73
    2.3.4 SPF1基因缺失对白念珠菌正常生长速率的影响  73-75
    2.3.5 SPF1基因缺失对白念珠菌形态发生能力的影响  75-81
    2.3.6 SPF1基因缺失对白念珠菌压力应答能力的影响  81-86
    2.3.7 SPF1基因缺失对白念珠菌毒力的影响  86-87
  第四节 讨论  87-91
    2.4.1 内质网钙泵Spf1蛋白的鉴定  87-88
    2.4.2 Spf1在白念珠菌正常生长过程中的功能  88-89
    2.4.3 Spf1在白念珠菌形态发生中的功能  89-90
    2.4.4 Spf1在白念珠菌压力应答中的功能  90-91
    2.4.5 Spf1在白念珠菌致病过程中的作用  91
  第五节 小结  91-93
第三章 内质网钙泵Spf1在白念珠菌形态发生及压力应答过程中的作用机制  93-134
  第一节 实验材料  94-100
    3.1.1 菌株、质粒与引物  94-97
    3.1.2 主要仪器  97
    3.1.3 主要试剂  97-99
    3.1.4 培养基  99-100
  第二节 实验方法  100-111
    3.2.1 大肠杆菌的电转化  100
    3.2.2 酿酒酵母的转化  100-101
    3.2.3 白念珠菌Cdcl01的血凝素(HA)标记  101-102
    3.2.4 白念珠菌内质网功能基因SEC61启动子报告质粒的构建  102
    3.2.5 白念珠菌胞质钙及总钙含量的测定  102-104
    3.2.6 分泌型酸性磷酸酶(SAP)分析  104
    3.2.7 内切糖苷酶(EndoH)分析  104
    3.2.8 白念珠菌细胞壁组成分析  104-105
    3.2.9 白念珠菌细胞壁压力敏感性测定  105-106
    3.2.10 白念珠菌原生质体制备及再生  106
    3.2.11 β-半乳糖苷酶活性分析  106-107
    3.2.12 白念珠菌RNA提取、基因组DNA消化及RNA反转录  107-110
    3.2.13 实时定量PCR(RT-PCR)  110
    3.2.14 其他方法  110-111
  第三节 结果与分析  111-127
    3.3.1 SPF1基因缺失对白念珠菌钙稳态的影响  111-112
    3.3.2 SPF1基因缺失对白念珠菌内质网功能的影响  112-115
    3.3.3 SPF1基因缺失对白念珠菌细胞壁组成与功能的影响  115-118
    3.3.4 SPF1基因缺失对白念珠菌基因表达的影响  118-127
  第四节 讨论  127-132
    3.4.1 Spf1在白念珠菌细胞钙稳态维持中的作用  127-129
    3.4.2 Spf1在白念珠菌内质网功能维持中的作用  129-130
    3.4.3 Spf1在白念珠菌CWI维持中的作用  130-131
    3.4.4 SPF1基因缺失对白念珠菌基因表达的影响  131-132
  第五节 小结  132-134
第四章 液泡钙通道Yvc1在白念珠菌形态发生及压力应答中的作用  134-175
  第一节 实验材料  134-138
    4.1.1 菌株、质粒与引物  134-136
    4.1.2 主要仪器  136
    4.1.3 主要试剂  136-138
  第二节 实验方法  138-143
    4.2.1 YVC1回补质粒pDDB78-YVC1的构建  138
    4.2.2 YVC1回补菌株及URA3原位回补菌株的构建  138-139
    4.2.3 白念珠菌生长曲线的测定  139
    4.2.4 胞质钙浓度检测  139
    4.2.5 菌丝诱导  139-140
    4.2.6 侵染式生长能力测定  140
    4.2.7 絮凝能力测定  140
    4.2.8 生物被膜形成能力测定  140
    4.2.9 白念珠菌氧化压力敏感性及相关生理生化指标的测定  140-141
    4.2.10 RT-PCR  141-142
    4.2.11 液泡、顶体及胞质钙的荧光显微观察  142
    4.2.12 小鼠系统性感染模型  142
    4.2.13 上皮细胞侵染模型  142-143
  第三节 结果与分析  143-165
    4.3.1 YVC1回补菌株及URA3原位回补菌株的构建  143-145
    4.3.2 YVC1缺失对白念珠菌压力敏感性的影响  145-150
    4.3.3 YVC1缺失对白念珠菌压力刺激下钙波动的影响  150-152
    4.3.4 YVC1缺失对白念珠菌形态发生能力的影响  152-156
    4.3.5 YVC1缺失对白念珠菌液泡、顶体及胞质钙分布的影响  156-160
    4.3.6 YVC1缺失对白念珠菌毒力的影响  160-165
  第四节 讨论  165-173
    4.4.1 Yvc1在白念珠菌压力应答中的作用  165-166
    4.4.2 Yvc1在白念珠菌形态发生中的作用  166-169
    4.4.3 Yvc1在白念珠菌致病过程中的作用  169-170
    4.4.4 钙信号系统介导白念珠菌形态发生及压力应答的相关机制  170-173
  第五节 小结  173-175
第五章 钙通道阻断剂对白念珠菌形态发生及压力应答的影响  175-207
  第一节 实验材料  176-177
    5.1.1 菌株及引物  176
    5.1.2 主要仪器  176-177
    5.1.3 主要试剂  177
    5.1.4 培养基  177
  第二节 实验方法  177-184
    5.2.1 碱性pH刺激下白念珠菌胞质钙浓度的测定  177-178
    5.2.2 药物压力下白念珠菌胞质钙及总钙含量的测定  178-179
    5.2.3 β-半乳糖苷酶分析  179
    5.2.4 钙通道阻断剂对白念珠菌生长抑制效果的测定  179-180
    5.2.5 钙通道阻断剂与抗真菌药物联用对白念珠菌生长抑制效果的测定  180
    5.2.6 verapamil对白念珠菌菌丝发育抑制效果的测定  180-181
    5.2.7 verapamil对白念珠菌生物被膜抑制效果的测定  181-182
    5.2.8 verapamil与抗真菌药物联用对生物被膜形成抑制效果测定  182-183
    5.2.9 verapamil与抗真菌药物联用对生物被膜维持抑制效果测定  183
    5.2.10 RT-PCR  183-184
  第三节 结果与分析  184-201
    5.3.1 钙通道阻断剂对碱性刺激下胞质钙波动的影响  184-187
    5.3.2 钙通道阻断剂对药物压力下胞质钙及总钙含量的影响  187-191
    5.3.3 钙通道阻断剂对白念珠菌正常生长的影响  191
    5.3.4 钙通道阻断剂对白念珠菌药物耐受性的影响  191-193
    5.3.5 verapamil对白念珠菌菌丝发育的影响  193-196
    5.3.6 verapamil对白念珠菌生物被膜发育的影响  196-200
    5.3.7 verapamil对白念珠菌形态发生相关基因表达的影响  200-201
  第四节 讨论  201-205
    5.4.1 钙通道阻断剂对白念珠菌钙内流的抑制作用  201-203
    5.4.2 钙通道阻断剂对白念珠菌药物压力应答的影响  203
    5.4.3 钙通道阻断剂对白念珠菌形态发生的影响  203-205
  第五节 小结  205-207
第六章 结论与展望  207-211
  6.1 结论  207-208
  6.2 主要创新点  208-209
  6.3 相关工作的前景展望  209-211
参考文献  211-226
致谢  226-228
附录  228-233
个人简历及在学期间发表的学术论文  233-234

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