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脑膜炎奈瑟氏菌荚膜抗原基因簇的研究和遗传分型方法的建立

作 者: 朱宏飞
导 师: 王磊
学 校: 南开大学
专 业: 微生物学
关键词: 脑膜炎奈瑟氏菌 荚膜基因簇 检测 大肠杆菌 O抗原
分类号: R378
类 型: 博士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


I脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)是专性人类寄生的革兰氏阴性致病菌,可以引起脑膜炎和败血症等,由于它的致畸率、致死率和发病率一直较高,所以这种细菌引起的传染病一直是人类健康的巨大威胁。鉴于脑膜炎奈瑟氏菌的重要性,有必要对它进行比较深入的研究。脑膜炎奈瑟氏菌主要是通过空气、飞沫和密切的接触进行传播,呼吸道首先接触到这类细菌。在大约10%人的鼻腔中携带脑膜炎奈瑟氏菌并且不致病,一旦这种细菌有机会穿过血脑屏障进入血液或者是脑脊液就会引发严重的传染性疾病。脑膜炎奈瑟氏菌的细胞外覆盖的荚膜是重要的毒力因子,根据脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜成分和免疫反应性等特点,将脑膜炎奈瑟氏菌分为12个血清群,即A、B、C、Y、W135、29E、X、Z、H、I、K和L等血清群,而A、B、C、W135, X和Y血清群的菌株引起90%以上的感染,属于常见的血清群,而其余的几个血清群常被称为稀有血清群,它们引起的只是零星的感染或者是处于携带状态。关于常见血清群的报道要比稀有血清群的多。A、B、C、29E、W135, X和Y血清群的菌株荚膜基因簇序列可以在GenBank数据库中找到,而H、I、K、L和Z等血清群菌株的荚膜基因簇至今还没有破译,这对于针对荚膜的疫苗研发和针对防控的血清群的检测以及进化研究造成严重的障碍,所以有必要破译H、I、K、L和Z等血清群菌株的荚膜基因簇,分析它们荚膜基因簇内的基因功能,特别是荚膜多糖的合成和转运基因,它们的序列对于种和血清群的检测十分必要。本研究的首要任务利用鸟枪库破译了H、I、K、L和Z等血清群菌株的荚膜基因簇,分别得到了23,488、24,676、27,709、18,453和21,871bp的序列,注释出来与这些序列相对应的开放阅读框分别是19、18、22、14和15。通过Clustal X的比对发现I和K血清群的荚膜基因簇序列一致性达到了99%,而它们的荚膜多糖成分所有不同,所以推测造成荚膜多糖成分不同的一个异构酶基因应该位于荚膜基因簇之外。Glycerol-3-PO4是H和Z血清群的荚膜多糖的共有成分,它们的基因种类和功能也有一定的相似性。在序列和基因种类比较的基础上,本研究分析了脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜基因簇的整体进化特点。本研究的第二个任务就是利用血清群特异性的基因和脑膜炎奈瑟氏菌的种特有基因,开发了能够检测所有12个血清群的多重PCR实验,连续使用三个多重PCR可以区分全部的血清群,多重PCR实验还可以把血清学上分不了群的菌株通过这种遗传学的方法直接分群。在检测中能够快速有效地区分稀有血清群和不可分群菌株的血清群类型。每个被检测的脑膜炎奈瑟氏菌都应该得到三个扩增子,其中的一个扩增子是利用条带大小不同来区分血清群,另外两个条带,即ctrA和porA都是鉴定种,排除亲缘关系比较近的淋病奈瑟氏菌和嗜乳糖奈瑟氏菌。用于分群检测的多重PCR实验的性能要用准确性和灵敏度来验证。97个已知血清群的临床分离脑膜炎奈瑟氏菌株对多重PCR准确性进行检验,得到准确率为100%。46个未知血清群的临床分离株作为多重PCR的双盲实验标本。最后的多重PCR试验的结果和血清学上的分群结果进行比对,结果是准确率达到了98%。经过多次的重复试验,最后确定了基因组DNA和在非培养条件下的模拟临床脑脊液标本中菌株数量的灵敏度。本研究所有的血清群的基因组DNA的灵敏度是1ng/20μL,相当于~4×105个基因组数量。非培养模拟脑脊液标本的灵敏度是~3×105CFU/ml,可以直接用于临床脑脊液标本或者是菌株基因组DNA的分群检测。II大肠杆菌(Escherichia. coli)为埃希氏菌属(Escherichia)的代表菌种,属于革兰氏阴性细菌。在自然界分布很广,是肠道的正常菌群,大多数不致病,属于条件致病菌。大肠杆菌细胞外有三种形式的抗原,即菌体(O)、荚膜(K)和鞭毛(H)等抗原。由于菌体外的脂多糖的结构类型很多,仅菌体抗原(O抗原)的种类就有180多个血清型。大肠杆菌在免疫力低下等情况可以引起肠道感染、粘膜感染和泌尿生殖道感染,还可以引起猪、牛和羊等家畜的疾病。脂多糖是大肠杆菌细胞外的主要表面成分,对致病性有很重要的作用,它的组成由核心多糖、O-特异性多糖侧链、类脂A三个部分共价连接而成。O-特异性多糖链又称O抗原多糖侧链,简称O抗原,具有多样性、稳定性和特异性的特点。负责O抗原合成的基因一般都是在细菌的染色体上成线性排列,大肠杆菌O抗原基因簇通常位于galF和gnd基因之间,少数例外。由于O抗原在细菌的致病性和进化的研究上有很重要的意义,本研究破译了大肠杆菌O41的O抗原基因簇,并测定了它的结构。经过序列分析发现,大肠杆菌O41的O抗原基因簇注释出12个开放阅读框,包括GDP-L-Fuc合成酶基因(gmd、fcl、gmm、manC和manB)、糖基转移酶基因(wfcV、wfcW、wfcX、wfcY和wfcZ)和寡糖单位处理酶基因(wzy和wzx),O抗原的合成属于Wzy/Wzx依赖型。测定的多糖结构式如下:通过和现有的多糖结构的比较,确定大肠杆菌O41的O抗原的多糖结构在细菌多糖中没有相同的类型,因此确定了这种结构是细菌中是独有的。

全文目录


摘要  5-11
Abstract  11-34
第一部分 脑膜炎奈瑟氏菌荚膜基因簇的破译及其血清群的多重 PCR检测  34-225
  第一章 前言  34-144
    第一节 研究背景简介  34-140
      1.1.1 脑膜炎奈瑟氏菌的背景简介  34-58
        1.1.1.1 脑膜炎奈瑟氏菌的生物学性状  34-35
        1.1.1.2. 脑膜炎奈瑟氏菌的传播途径  35-37
        1.1.1.3 脑膜炎奈瑟氏菌的分型方法  37-41
        1.1.1.4 脑膜炎奈瑟氏菌的致病性  41-44
        1.1.1.5 脑膜炎奈瑟氏菌中重要血清群的流行病学  44-50
        1.1.1.6 对抗脑膜炎奈瑟氏菌的疫苗(Vaccine)  50-56
        1.1.1.7 脑膜炎奈瑟氏菌的脂寡糖(LOS)  56-58
      1.1.2 革兰氏阴性细菌的荚膜多糖的研究进展  58-83
        1.1.2.1 革兰氏阴性细菌表面的荚膜多糖  58-63
        1.1.2.2 革兰氏阴性细菌的表面荚膜类型的划分  63-67
        1.1.2.3 脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖及其基因簇的研究进展  67-76
          1.1.2.3.1 脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖的成分  67-70
          1.1.2.3.2 脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜基因簇  70-76
        1.1.2.4 脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜转换  76-83
      1.1.3 比较实用的致病性细菌的快速检测方法  83-92
        1.1.3.1 PCR 检测方法的应用  84-86
        1.1.3.2 多重 PCR 在检验中的优势  86-87
        1.1.3.3 生物芯片技术的应用  87-92
      1.1.4 全基因组测序方面的研究进展  92-109
        1.1.4.1 脑膜炎奈瑟氏菌的基因组测序情况  95-97
        1.1.4.2 奈瑟氏菌的比较基因组杂交  97-103
        1.1.4.3 致病性奈瑟氏菌的基因组和遗传差异性的比较  103-105
        1.1.4.4 脑膜炎奈瑟氏菌的转录组学  105-109
      1.1.5 脑膜炎奈瑟氏菌的遗传学识别方法  109-140
        1.1.5.1 脑膜炎奈瑟氏菌的遗传学分型(群)方法  110-119
          1.1.5.1.1 脑膜炎奈瑟氏菌的 PCR 分群方法  111-118
          1.1.5.1.2 脑膜炎奈瑟氏菌的多糖免疫色谱分群方法  118-119
        1.1.5.2 脑膜炎奈瑟氏菌的单基因识别方法  119-129
        1.1.5.3 脑膜炎奈瑟氏菌的多位点序列分型方法 (MLST)  129-136
        1.1.5.4 脑膜炎奈瑟氏菌的脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型  136-139
        1.1.5.5 脑膜炎奈瑟氏菌的可变数量串联重复序列(VNTR)分型  139-140
    第二节 本研究的意义、内容、目标和创新性  140-144
      1.2.1 本研究的意义  140-142
      1.2.2 本研究内容  142
      1.2.3 本实验研究目标  142-143
      1.2.4 创新性  143-144
  第二章 材料与方法  144-162
    第一节 实验材料  144-148
      2.1.1 菌株  144-146
      2.1.2 质粒  146
      2.1.3 本研究主要用到的软件和数据库  146-147
      2.1.4 主要酶与试剂  147-148
      2.1.5 实验仪器  148
    第二节 实验方法  148-162
      2.2.1 利用鸟枪法构建基因簇文库  148-153
        2.2.1.1 细菌基因组 DNA 的提取  148-149
        2.2.1.2 荚膜基因簇的扩增及产物的纯化  149-150
        2.2.1.3 荚膜基因簇文库的构建  150-152
        2.2.1.4 质粒的提取  152-153
      2.2.2 荚膜基因簇全序列的获取  153-154
        2.2.2.1 对文库中的克隆进行测序  153-154
        2.2.2.2 核苷酸序列的拼接  154
        2.2.2.3 生物信息学分析  154
        2.2.2.4 绘制荚膜基因簇结构简图  154
      2.2.3 特异基因的筛选  154-155
      2.2.4 引物的设计和筛选  155-159
        2.2.4.1 脑膜炎奈瑟氏菌种和血清群特异性的引物设计  157
        2.2.4.2 引物的筛选  157-159
      2.2.5 多重 PCR 体系的建立和优化  159-160
      2.2.6 多重 PCR 实验的特异性检验和双盲验证法  160
      2.2.7 多重 PCR 实验的灵敏度确定  160-162
  第三章 结果与分析  162-210
    第一节 脑膜炎奈瑟氏菌荚膜基因簇的序列分析和注释  162-191
      3.1.1 脑膜炎奈瑟氏菌 H 血清群的荚膜基因簇的鉴定  162-172
        3.1.1.1 脑膜炎奈瑟氏菌 H 血清群的荚膜荚膜多糖的结构  162
        3.1.1.2 脑膜炎奈瑟氏菌 H 血清群的荚膜簇序列分析  162-172
          3.1.1.2.1 脑膜炎奈瑟氏菌 H 血清群的荚膜荚膜多糖的合成基因  166-168
          3.1.1.2.2 脑膜炎奈瑟氏菌 H 血清群的荚膜荚膜多糖的转运基因  168-169
          3.1.1.2.3 脑膜炎奈瑟氏菌 H 血清群的荚膜荚膜多糖的细胞表面定位基因  169-170
          3.1.1.2.4 脑膜炎奈瑟氏菌 H 血清群的荚膜荚膜基因簇的其它基因  170-172
      3.1.2 脑膜炎奈瑟氏菌 I 血清群的荚膜基因簇的鉴定  172-178
        3.1.2.1 脑膜炎奈瑟氏菌 I 血清群的荚膜荚膜多糖的结构  172-173
        3.1.2.2 脑膜炎奈瑟氏菌 I 血清群的荚膜簇序列分析  173-178
          3.1.2.2.1 脑膜炎奈瑟氏菌 I 血清群的荚膜多糖的合成基因  176-177
          3.1.2.2.2 脑膜炎奈瑟氏菌 I 血清群的荚膜基因簇中的其它基因  177-178
      3.1.3 脑膜炎奈瑟氏菌 K 血清群的荚膜基因簇的鉴定  178-183
        3.1.3.1 脑膜炎奈瑟氏菌 K 血清群的荚膜荚膜多糖的结构  178
        3.1.3.2 脑膜炎奈瑟氏菌 K 血清群的荚膜簇序列分析  178-179
        3.1.3.3 脑膜炎奈瑟氏菌 K 血清群的荚膜簇总体基因排列状况  179-183
      3.1.4 脑膜炎奈瑟氏菌 L 血清群的荚膜基因簇的鉴定  183-186
        3.1.4.1 脑膜炎奈瑟氏菌 L 血清群的荚膜荚膜多糖的结构  183
        3.1.4.2 脑膜炎奈瑟氏菌 L 血清群的荚膜簇序列分析  183-186
          3.1.4.2.1 脑膜炎奈瑟氏菌 L 血清群的荚膜多糖的合成基因  186
          3.1.4.2.2 脑膜炎奈瑟氏菌 L 血清群的其它基因  186
      3.1.5 脑膜炎奈瑟氏菌 Z 血清群的荚膜基因簇的鉴定  186-191
        3.1.5.1 脑膜炎奈瑟氏菌 Z 血清群的荚膜荚膜多糖的结构  186-187
        3.1.5.2 脑膜炎奈瑟氏菌 Z 血清群的荚膜簇序列分析  187-191
          3.1.5.2.1 脑膜炎奈瑟氏菌 Z 血清群的荚膜多糖的合成基因  191
          3.1.5.2.2 脑膜炎奈瑟氏菌 Z 血清群的其它基因  191
    第二节 脑膜炎奈瑟氏菌荚膜基因簇的整体分析  191-202
      3.2.1 脑膜炎奈瑟氏菌 B、C、D 和 E 区基因的特点  191-192
      3.2.2 脑膜炎奈瑟氏菌 A 区基因的特点  192
      3.2.3 脑膜炎奈瑟氏菌荚膜基因簇的分组  192-202
    第三节 基于荚膜基因簇的遗传分型  202-208
      3.3.1 特异基因的筛选  202
      3.3.2 筛选到的引物  202-203
      3.3.3 多重 PCR 反应的优化结果  203-208
        3.3.3.1 引物分组的结果  203-204
        3.3.3.2 引物浓度的优化结果  204-206
        3.3.3.3 优化了的多重 PCR 反应条件和体系  206-208
    第四节 多重 PCR 系统性能的评价  208-210
      3.4.1 多重 PCR 反应的特异性实验  208-209
      3.4.2 多重 PCR 反应的双盲实验  209
      3.4.3 多重 PCR 反应的灵敏度的评价  209-210
  第四章 讨论  210-221
    第一节 从脑膜炎奈瑟氏菌荚膜基因簇的总体特征总结进化特点  210-213
    第二节 多重 PCR 中 ctrA 和 porA 的共用  213-215
    第三节 遗传学方法解决血清学上不可分群问题  215-217
    第四节 改进多重 PCR 检测方法与灵敏度的提高  217-219
    第五节 致病菌分子检测方法的优势  219-221
  第五章 结论和展望  221-225
    第一节 结论  221-223
    第二节 展望  223-225
第二部分 大肠杆菌 O41 O 抗原结果的测定和基因簇的分析  225-321
  第一章 前言  225-293
    第一节 研究背景简介  225-290
      1.1.1 大肠杆菌的背景简介  225-240
        1.1.1.1 大肠杆菌的生物学性状  225-227
        1.1.1.2 大肠杆菌对人类的致病性  227-236
        1.1.1.3 大肠杆菌的引起的家禽和牲畜疾病  236-239
        1.1.1.4 大肠杆菌的模式生物地位  239-240
      1.1.2 革兰氏阴性菌 O 抗原的研究进展  240-276
        1.1.2.1 脂多糖  242-253
          1.1.2.1.1 脂多糖基本结构和化学组成[140]  244-249
          1.1.2.1.2 脂多糖的生物学功能  249-253
        1.1.2.2 O 抗原基因簇的研究进展  253-269
        1.1.2.3 O 抗原的合成途径  269-276
      1.1.3 O 抗原多糖的研究  276-287
        1.1.3.1 多糖的研究状况和技术  276-279
        1.1.3.2 糖类药物和生物酶法的多糖合成  279-283
        1.1.3.3 糖是生物体里重要的功能分子  283-287
      1.1.4 研究 O 抗原多样性形成的意义  287-290
    第二节 本研究的意义、内容、目标和创新性  290-293
      1.2.1 本研究的意义  290-291
      1.2.2 本研究内容  291
      1.2.3 本实验研究目标  291
      1.2.4 创新性  291-293
  第二章 材料与方法  293-299
    第一节 实验材料  293-294
      2.1.1 菌株  293
      2.1.2 质粒、软件和数据库等  293
      2.1.3 主要试剂以及实验仪器等  293-294
    第二节 实验方法  294-299
      2.2.1 运用鸟枪法构建基因簇文库  294-296
        2.2.1.1 培养基及试剂配制  294
        2.2.1.2 DNA 的提取操作步骤  294-295
        2.2.1.3 O 抗原基因簇的扩增及产物的纯化  295-296
        2.2.1.4 O 抗原基因簇的文库的构建  296
        2.2.1.5 测序 pUC18 质粒的提取  296
      2.2.2 O 抗原基因簇全序列的获取  296
      2.2.3 O 抗原脂多糖的提取  296-299
        2.2.3.1 大肠杆菌 O41 单克隆的获取  296-297
        2.2.3.2 大肠杆菌 O41 大量脂多糖的提取  297-298
        2.2.3.3 大肠杆菌 O41 脂多糖的提取  298
        2.2.3.4 大肠杆菌 O41 的 O 抗原的单糖分析  298
        2.2.3.5 大肠杆菌 O41 的 O 抗原的 NMR 分析  298-299
  第三章 结果与分析  299-308
    第一节 大肠杆菌 O41 的 O 抗原基因簇的序列分析和注释  299-305
      3.1.1 大肠杆菌 O41 的 O 抗原的单糖合成酶基因  302-303
      3.1.2 大肠杆菌 O41 的 O 抗原的糖基转移酶基因  303
      3.1.3 大肠杆菌 O41 的 O 抗原的寡糖单位处理基因  303-305
    第二节 大肠杆菌 O41 的 O 抗原基因簇的多糖结构  305-308
      3.2.1 大肠杆菌 O41 的 O 抗原的结构  305
      3.2.2 大肠杆菌 O41 的 O 抗原的结构分析过程  305-308
  第四章 讨论  308-320
    第一节 从大肠杆菌 O 抗原基因簇的总体特征总结进化特点  308-315
      4.1.1 大肠杆菌的 O 抗原的结构多样性  308-309
      4.1.2 大肠杆菌 O41 的 O 抗原基因簇符合 O 抗原基因簇的总体特点  309-310
      4.1.3 大肠杆菌 O41 的 O 抗原基因簇符合的总体进化特点169  310-312
      4.1.4 大肠杆菌 O41 的 O 抗原基因簇与 O 抗原结构之间对应  312-314
      4.1.5 大肠杆菌 O41 的 O 抗原基因簇与其它基因簇之间相似性  314-315
    第二节 大肠杆菌 O41 的 O 抗原多糖的特点  315-320
      4.2.1 大肠杆菌 O41 的 O 抗原的结构是独有的  315-316
      4.2.2 大肠杆菌 O41 的 O 抗原的结构中发现罕见单糖  316-320
  第五章 结论  320-321
参考文献  321-358
致谢  358-360
附录  360-369
个人简历及攻读博士期间发表的论文  369-372

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