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重要条件致病菌可移动基因组的研究

作 者: 张杰
导 师: 贾士儒
学 校: 天津科技大学
专 业: 生物化工
关键词: 基因组岛 肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌 整合型质粒 比较基因组学
分类号:
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


比较基因组分析揭示了细菌基因组的多样性,同个种内不同菌株的染色体除了拥有保守骨架外,还有一些菌株特异的、通过水平转移获得的可移动基因组。可移动遗传学元件上所携带的外源基因有助于维持宿主在特定生态环境中获得优势。其中,基因组岛经常整合到宿主染色体上tRNA/tmRNA基因的3’-端。本实验以医源性感染重要的条件致病菌肺炎克雷伯菌铜绿假单胞菌为研究对象,结合生物信息学和分子实验技术搜索了tRNA/tmRNA基因相关联的新基因组岛,快速挖掘外源基因池,以期深入地理解细菌基因组多样性和基因水平转移机制,为阐明致病分子机理和抗生素抗性传播机制积累数据。本实验首先采用生物信息学方法tRNAcc比较分析了3个已完成全基因组测序肺炎克雷伯菌中基因组岛。从86个已知tRNA基因和1个tmRNA基因中识别出了8个热点tRNA/tmRNA基因(thr5, arg6, asn33, asn34, phe55, met56, leu82和tmRNA gene),及14个基因组岛,长度从3kb到87kb。其次,用位点特异性的tRIP PCR和Long-Range PCR技术考察了28个不同来源的肺炎克雷伯菌,发现这些从环境或临床分离到的肺炎克雷伯菌株在8个tRNA/tmRNA位点的上显示出外源DNA片段插入的多样性。最后,重点分析了其中一个插入热点tmRNA基因,对Long-Range PCR产物进行测序和注释,获得了5个新的基因组岛:tmGI_Kp20093(15.4kb, G+C content=46.4%), tmGI_kp10011(17.5kb, G+C content=46.4%), tmGI_Kp49790(12.7kb, G+C content=48.6%), tmGI_Kp44(9.0kb, G+C content=44.3%) R tmGI_Kp63(12.0kb, G+C content=50.3%)。两侧的正向重复序列,低G+C含量和二核苷酸分布高偏向性等序列特征支持这些岛是通过水平转移插入到宿主染色体上的tmRNA基因位点。这些岛共携带了75个蛋白质编码基因,其中55个(73.3%)编码了在肺炎克雷伯菌中新发现的蛋白。对这些新基因的生物学功能的分析正在进行中。此外,本实验构建了作用于肺炎克雷伯菌55_phe位点的酵母捕捉载体YCV55,初步实现了利用酵母同源重组系统精确定向克隆大基因组岛的技术方案。本实验还用相似的策略对25株铜绿假单胞菌临床菌株染色体上的9个tRNA/tmRNA基因位点考察其是否有基因岛插入。发现了多重耐药的铜绿假单胞菌临床菌株HS87中的一个天然质粒pHS87b能特异地整合到宿主染色体的thr61tRNA基因位点。此外,完成了该质粒及铜绿假单胞菌HS87中的另一个天然质粒pHS87a的测序和注释,初步分析了新发现的一个毒素-抗毒素系统和多个抗生素抗性基因。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
符号说明  9-10
1 前言  10-26
  1.1 可移动基因组简介  10-21
    1.1.1 基因组岛的进化  10-12
    1.1.2 基因组岛的功能  12-19
    1.1.3 基因组岛的生活环境  19
    1.1.4 鉴定基因组岛的方法  19-20
    1.1.5 定向克隆基因组岛的方法  20-21
  1.2 肺炎克雷伯菌  21-22
    1.2.1 肺炎克雷伯菌的基本特征  21
    1.2.2 肺炎克雷伯菌的流行病学研究  21
    1.2.3 克雷伯菌的致病因子  21-22
  1.3 铜绿假单胞菌  22-23
    1.3.1 铜绿假单胞菌的基本特征  22
    1.3.2 铜绿假单胞菌的基因组特征  22-23
    1.3.3 铜绿假单胞菌的致病性  23
  1.4 本研究的立题依据及采取的技术路线  23-26
2 材料与方法  26-40
  2.1 实验材料  26-30
    2.1.1 菌株和质粒  26-29
    2.1.2 培养基和化学试剂  29
    2.1.3 本实验所用的酶及主要试剂  29-30
  2.2 实验方法  30-37
    2.2.1 生物信息学分析  30-31
    2.2.2 菌种培养及保藏  31
    2.2.3 DNA的提取及操作  31-35
    2.2.4 在大肠杆菌中导入外源DNA  35
    2.2.5 酵母醋酸锂转化法  35-36
    2.2.6 酵母菌落原位PCR  36
    2.2.7 tRIP PCR的反应体系及反应条件  36-37
    2.2.8 Long-Range PCR的反应体系及反应条件  37
  2.3 实验中使用的引物  37
  2.4 测序工作  37-40
3 结果与讨论  40-67
  3.1 耐药性条件致病菌肺炎克雷伯菌的基因组岛分析  40-59
    3.1.1 已测序的肺炎克雷伯菌基因组岛的识别及tRIP PCR引物设计  40-44
    3.1.2 16S rRNA PCR分析  44
    3.1.3 tRIP PCR及Long-Range PCR分析  44-46
    3.1.4 tmRNA基因插入热点基因组岛的研究  46-51
    3.1.5 SGSP PCR结果及分析  51-52
    3.1.6 其它肠杆菌中tmRNA基因位点基因组岛的分布情况  52-55
    3.1.7 构建55_phe基因位点酵母捕捉载体定向克隆基因组岛  55-57
    3.1.8 肺炎克雷伯菌基因池的构建  57-59
  3.2 耐药性条件致病菌铜绿假单胞菌的基因组岛分析  59-67
    3.2.1 铜绿假单胞菌基因组岛的搜寻  59-60
    3.2.2 整合型质粒pHS87b  60-61
    3.2.3 铜绿假单胞菌HS87中两个天然质粒的发现及验证  61-62
    3.2.4 序列和注释  62
    3.2.5 氨基糖苷6’-N-乙酰转移酶基因表达菌株的构建和验证  62-64
    3.2.6 毒素/抗毒素系统  64-67
4 结论  67-68
5 展望  68-69
6 参考文献  69-78
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  78-79
8 致谢  79-80
附录  80-89

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