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人淀粉代谢相关α-1，4糖苷酶类与其抑制剂相互作用机制的结构生物学研究

作　者: 任丽梅
导　师: 白钢
学　校: 南开大学
专　业: 微生物学
关键词: 淀粉酶 麦芽糖苷酶 α-淀粉酶抑制剂 蛋白纯化 结构生物学
分类号:
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


淀粉经过人体代谢消化产生终产物葡萄糖的过程涉及到一系列的α-糖苷酶类，如唾液淀粉酶（HSΑ），胰腺淀粉酶（HPΑ），麦芽糖苷酶（maltase-glucoamylase,MGΑM），蔗糖糖苷酶（sucrose-isomaltase,SI）等。而α-糖苷酶抑制剂（α-glycosidase inhibitor，ΑGI）可以抑制最终产物葡萄糖的产生，从而抑制餐后高血糖，对于2型糖尿病有很好的治疗效果。通过研究α-糖苷酶抑制剂与靶点α-糖苷酶间的作用机理不仅可以深入了解酶分子的作用方式并且有助于开发设计更高药效的α-糖苷酶抑制剂类药物。本研究首先从淀粉的α-1,4糖苷键内切相关酶类的克隆、表达入手，成功构建人胰腺淀粉酶（HPΑ），麦芽糖苷酶N端结构域（MGAM-N）,麦芽糖苷酶C端结构域（MGAM-C）的毕赤酵母表达菌株，分别命名为HPA-GS115，MGAM-N-GS115，MGAM-C-GS115。首次报道了人MGAM-C蛋白的克隆表达，使得同时研究HPA，MGAM-N与MGAM-C的性质成为可能。随后利用不同的蛋白纯化方法，如糖原沉淀、疏水层析、金属离子亲和层析、离子交换层析和分子排阻层析等成功获得了高纯度的HPA、MGAM-N和MGAM-C重组蛋白，其酶活力分别为136.5U/mg、5.15U/mg和20.23U/mg。分别以HPA、MGAM-N和MGAM-C重组蛋白为材料，在酶学水平研究其在糖代谢途径中的催化作用。通过不同的α-葡萄糖苷酶抑制剂对HPA、MGAM-N和MGAM-C的抑制情况来分析HPA、MGAM-N和MGAM-C的催化特异性、底物特异性以及对不同α-葡萄糖苷酶抑制剂的耐受性。使我们对α-糖苷酶抑制剂的抑制能力在整体轮廓上有更深刻的认识。研究结果表明，1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojimycin, DNJ）是MGAM最有效的抑制剂，其对两个催化结构域MGAM-N和MGAM-C的Ki值分别达到了1.41和2.04μM。而阿卡他定类化合物Acarviostatin2-03和3-03（A2-03，A3-03）是HPA的最佳抑制剂，Ki值分别为15和14.3nM。A2-03，A3-03同时也对MGAM-C显示出相对较高的抑制活性，其Ki值分别为6.02μM和6.08μM。研究发现，尽管MGAM-N和MGAM-C结构同源性很高，但它们具有不同的底物特异性以及α-葡萄糖苷酶抑制活性。以高纯度的HPA为材料获得高分辨率的A1-03，A2-03，A3-03，A4-03与HPA的复合晶体。结构生物学分析表明，A1-03具备与acarbose类似的重排模式。A1-03在HPA活性中心经历了一系列的水解和缩合反应，最终产生6个糖环的重排产物占据HPA的活性中心。与此同时，A2-03，A3-03和A4-03只进行水解反应，最终以7个糖环的终产物占据HPA活性中心。结合结构生物学与酶学动力学分析表明：经水解和重排修饰的7个糖环的终产物是最适合HPA活性中心的抑制剂结构，显示了最强的抑制效果。同时高分辨率的晶体结构首次显示了acarviostatins中A2-03，A3-03，A4-03抑制剂的重排产物与HPA活性部位的-4位点均发挥作用，从而能更好的抑制HPA的催化活性，为新型HPA靶标药物分子设计提供重要靶点信息。同时，本论文首次解析了MGAM-C以及与acarbose复合晶体结构。结果显示acarbose分子结合于MGAM-C催化活性中心部位，占据-1到+3位点，acarviosine单元中的N-连接糖苷键占据催化中心的-1到+1位中间部位。酶学动力学研究表明：MGAM-N对G2至G6的糖环底物具有类似的结合常数。但MGAM-C对G3至G6糖环底物有更强的亲和能力，而对于麦芽糖（G2）的亲和能力则较低。这表明MGAM-N和MGAM-C活性中心对于不同长度底物存在选择性。而通过Dpn1介导了活性位点的定点突变获得了MGAM-N-Y299W，MGAM-C-Y1251W和MGAM-C-deltaS毕赤酵母表达突变菌株。突变体酶活性分析结果显示：酪氨酸（Y1251W）到色氨酸的突变赋予了MGAM-C酶分子水解α-1,6糖苷键能力；MGAM-C结构中存在的21个额外的氨基酸赋予了其对长底物片段更好的偏好性；而敲除此段序列后其底物特异性与MGAM-N非常类似，这在一定程度上解释了MGAM-N，MGAM-C和SI-N不同的底物特异性的分子机制。本研究利用毕赤酵母表达系统分别克隆表达并纯化了HPA、MGAM-N和MGAM-C重组蛋白，研究其酶学性质以及与不同α-糖苷酶抑制剂的相互作用关系，并获得acarviostatin1-03，2-03，3-03，4-03与HPA的复合晶体，以及MGAM-C与Acarbose的晶体结构。对人体内淀粉中α-1,4糖苷键水解相关酶类进行了较全面的研究。这些研究结果基本阐明了acarviostatin类药物与HPA的作用机制，明确了MGAM-C活性位点与Acarbose间作用方式，为以α-糖苷酶为靶点的降糖新药设计与开发奠定了基础。

全文目录


中文摘要  5-7
Abstract  7-15
第一章 引言  15-40
  第一节 糖尿病以及糖尿病药物研究概述  15-19
    1.1.1 糖尿病概述  15-16
    1.1.2 糖尿病治疗药物概述  16-19
    1.1.3 糖尿病治疗药物发展趋势  19
  第二节 人体淀粉代谢途径中重要的α-糖苷酶  19-30
    1.2.1 人体内淀粉代谢过程概述  19-20
    1.2.2 α-淀粉酶  20-24
    1.2.3 麦芽糖苷酶（MGAM）和蔗糖酶（SI）  24-28
    1.2.4 葡萄糖在体内的吸收  28-30
  第三节 α-糖苷酶抑制剂类药物发展现状  30-34
    1.3.1 Acarviostatins 类抑制剂  30-31
    1.3.2 其它小分子抑制剂  31-34
  第四节 毕赤酵母表达系统  34-36
    1.4.1 酵母表达系统与大肠杆菌表达系统优缺点比较  34
    1.4.2 毕赤酵母表达系统简介  34-36
  第五节 蛋白质晶体学与药物分子设计  36-38
    1.5.1 蛋白质晶体学概述  36-38
    1.5.2 蛋白质晶体学与药物分子设计  38
  第六节 本研究的目的与意义  38-40
第二章 HPA，MGAM-N 和 MGAM-C 重组蛋白的克隆和表达  40-61
  第一节 材料与方法  41-53
    2.1.1 实验材料  41-44
    2.1.2 实验方法  44-53
  第二节 实验结果  53-59
    2.2.1 毕赤酵母 HPA 产菌株的获得  53-55
    2.2.2 毕赤酵母 MGAM-N / C 高产菌株的获得  55-59
  第三节 讨论与小结  59-61
第三章 HPA，MGAM-N 和 MGAM-C 重组蛋白的表达，纯化和活性鉴定  61-80
  第一节 材料与方法  62-69
    3.1.1 实验材料  62-65
    3.1.2 实验方法  65-69
  第二节 实验结果  69-78
    3.2.1 HPA-GS115 的发酵培养与 HPA 的纯化  69-72
    3.2.2 MGAM-N/C-GS115 毕赤酵母的发酵培养和 MGAM-N/C 的纯化  72-78
  第三节 讨论与小结  78-80
第四章 HPA，MGAM-N 和 MGAM-C 在人体糖代谢途径中催化作用的研究  80-93
  第一节 材料与方法  82-86
    4.1.1 实验材料  82-83
    4.1.2 实验方法  83-86
  第二节 实验结果  86-90
    4.2.1 MGAM-N 与 MGAM-C 催化底物特异性初步研究  86
    4.2.2 不同α-糖苷酶抑制剂对 HPA，MGAM-N 和 MGAM-C 抑制研究  86-90
  第三节 讨论与小结  90-93
第五章 Acarviostatins 与 HPA 复合晶体结构及其相互作用机制的研究  93-108
  第一节 材料与方法  94-96
    5.1.1 实验材料  94
    5.1.2 实验方法  94-96
  第二节 实验结果  96-103
    5.2.1 A1-03 与 HPA 复合晶体结构  96-100
    5.2.2 A1-03 与 HPA 复合晶体结构  100-102
    5.2.3 A2-03，A3-03，A4-03 与 HPA 复合晶体结构  102-103
  第三节 讨论与小结  103-108
    5.3.1 A1-03 可能的重排机制  103-105
    5.3.2 A2-03，A3-03，A4-03 可能的抑制机制  105-106
    5.3.3 为开发高效糖苷酶抑制剂类药物提供了新的靶位  106-107
    小结  107-108
第六章 人麦芽糖苷酶底物特异性的结构生物学研究  108-130
  第一节 材料与方法  109-114
    6.1.1 实验材料  109-110
    6.1.2 实验方法  110-114
  第二节 实验结果  114-124
    6.2.1 Acarbose 与 MGAM-C 复合晶体结构  114-119
    6.2.2 MGAM-C 活性位点结构  119
    6.2.3 MGAM-N-Y299W，MGAM-C-Y1251W 和 MGAM-C-deltaS 毕赤酵母表达菌株的获得以及蛋白纯化  119-120
    6.2.4 MGAM 底物特异性  120-124
  第三节 讨论与小结  124-130
    6.3.1 MGAM-C 以及 MGAM-C/acarbose 晶体结构  124-126
    6.3.2 MGAM 和 SI 结构与功能特异性分析  126-127
    6.3.3 MGAM-N-Y299W，MGAM-C-Y1251W 和 MGAM-C-deltaS 突变重组蛋白的获得与活性分析  127
    6.3.4 MGAM 体内组成形式和两亚基协同作用研究  127-129
    小结  129-130
总结与展望  130-132
创新点  132-133
参考文献  133-139
致谢  139-140
附录  140-145
个人简历  145
在学期间研究成果  145-146

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