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hTERT靶向性amiRNA的筛选及其在scrAAV中的表达优化研究

作 者: 唐明青
导 师: 许瑞安
学 校: 华侨大学
专 业: 生物化工
关键词: RNA干扰 人工microRNA 人工microRNA载体 小RNA深度测序 表达框
分类号:
类 型: 博士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


研究背景:作为一种高效的基因调控手段,RNA干扰具有靶点专一、用量小等优点,被广泛应用于基因治疗等领域。传统的短发夹RNA载体虽然解决了常规小RNA短时效的缺点,但却伴随严重的细胞毒作用。基于內源microRNA的新一代人工microRNA载体(amiRNA)可以很好解决载体安全性问题,表达效率却不尽如人意。如何提高amiRNA载体的表达效率是目前小RNA载体急需解决的问题,amiRNA载体的优化工作对推动RNA干扰研究及其基因药物的发展意义重大。研究目的:本论文的主要目的是解决目前amiRNA载体表达中存在的瓶颈问题,获得高表达效率的新型amiRNA载体,加速小RNA基因药物的临床应用。研究方法:(1)利用Block-iT RNAi Designer软件设计靶向人端粒酶逆转录酶基因的amiRNA序列;(2)通过荧光定量、Western-Blot、Telochaser、细胞增殖、迁移、凋亡、血管生成、移植瘤实验来分析amiRNA的沉默效应和抗肿瘤活性;(3)借助报告基因沉默实验和基因芯片技术分析amiRNA的特异性和安全性;(4)依据miRNA引导序列的长度、指纹图谱、自由能等特征值差异来确定不同物种间miRNA表达框的通用性;(5)根据主要miRNA引导序列的表达丰度筛选出理论上具有高表达效率的表达框;(6)已验证的amiRNA序列、miRNA表达框和自身互补型腺相关病毒(scrAAV)通过重组产生scrAAV-amiRNA质粒载体;(7)三质粒共转法包装scrAAV-amiRNA病毒载体;(8)应用荧光定量和蛋白电泳技术对scrAAV-amiRNA病毒进行表征;(9)采用stem-loop RT qPCR来评价scrAAV-amiRNA病毒对目的amiRNA的表达效率;(10)使用小RNA深度测序来构建amiRNA成熟序列的表达图谱。研究结果:(1)成功筛选2条特异性抑制肿瘤细胞增殖、迁移与血管生成,促进肿瘤细胞凋亡、靶向人端粒酶逆转录酶基因的amiRNA序列;(2)以商品化表达框为基础的scrAAV-pcDNA6.2-amiRNA载体能表达目的amiRNA,但表达量低,沉默效应不显著;(3)不同物种间miRNA表达框的通用性跟物种间的进化关系相吻合;(4)优化后的scrAAV-opt-amiRNA载体表达效率最大提高近6倍;(5)scrAAV-opt-amiRNA表达的成熟序列多为异构序列,有效序列比例偏低。研究结论:(1)通过miRNA深度测序分析可以实现amiRNA载体的表达优化;(2)有效amiRNA成熟序列的含量是amiRNA载体表达优化的重要指标。

全文目录


摘要  4-6
abstract  6-13
主要符号对照表  13-14
第1章 引言  14-35
  1.1 研究意义  14-15
  1.2 研究背景  15-30
    1.2.1 RNA干扰  15-21
    1.2.2 腺相关病毒  21-25
    1.2.3 端粒酶  25-30
  1.3 研究内容  30-31
  1.4 方法路线  31-33
    1.4.1 ami RNA的设计与筛选  31-32
    1.4.2 scrAAV-amiRNA的构建与验证  32
    1.4.3 scrAAV-amiRNA的优化与分析  32-33
  1.5 论文结构  33-35
    1.5.1 引言  33
    1.5.2 amiRNA的设计与筛选  33
    1.5.3 scrAAV-amiRNA的构建与验证  33
    1.5.4 scrAAV-amiRNA的优化与分析  33
    1.5.5 结论  33-35
第2章 amiRNA的设计与筛选  35-65
  2.1 材料  35-37
    2.1.1 实验对象  35
    2.1.2 实验耗材  35
    2.1.3 实验试剂  35-36
    2.1.4 实验设备  36-37
  2.2 方法  37-47
    2.2.1 amiRNA的设计、合成、配制  37
    2.2.2 细胞培养  37-38
    2.2.3 amiRNA转染  38
    2.2.4 siRNA 标记转染  38-39
    2.2.5 RNA 提取  39
    2.2.6 普通 RT-PCR  39-40
    2.2.7 荧光定量 PCR  40
    2.2.8 蛋白电泳  40-42
    2.2.9 Western Blot  42-43
    2.2.10 端粒酶活性测定  43-44
    2.2.11 MTT 实验  44
    2.2.12 流式细胞术  44
    2.2.13 细胞凋亡染色  44-45
    2.2.14 线粒体膜电位检测  45
    2.2.15 Transwell 实验  45-46
    2.2.16 小管生成实验  46
    2.2.17 软琼脂克隆形成实验  46-47
    2.2.18 amiRNA 靶点克隆沉默实验  47
    2.2.19 裸鼠成瘤实验  47
    2.2.20 数据统计分析  47
  2.3 结果与分析  47-63
    2.3.1 设计、合成 2 对最佳 amiRNA 序列  47-48
    2.3.2 amiRNA 高效转染目的实验细胞  48-49
    2.3.3 amiRNA 显著下调 hTERT 的表达  49-50
    2.3.4 amiRNA 显著下调端粒酶活性  50-51
    2.3.5 amiRNA 特异性改变 hTERT 阳性肿瘤细胞的形态  51-52
    2.3.6 amiRNA 特异性抑制 hTERT 阳性肿瘤细胞的增殖  52-54
    2.3.7 amiRNA 特异性促进 hTERT 阳性肿瘤细胞的凋亡  54-57
    2.3.8 amiRNA 显著抑制细胞迁移和血管生成  57-58
    2.3.9 amiRNA 有效降低 hTERT 阳性肿瘤细胞的成瘤能力  58-60
    2.3.10 amiRNA-hTERT 主要通过影响 P53 信号通路发挥作用  60-62
    2.3.11 amiRNA 的特异性与安全性  62-63
  2.4 结论  63-65
第3章 scrAAV-amiRNA 的构建与验证  65-81
  3.1 材料  65-66
    3.1.1 实验对象  65
    3.1.2 实验耗材  65
    3.1.3 实验试剂  65
    3.1.4 实验设备  65-66
  3.2 方法  66-71
    3.2.1 pcDNA6.2-amiRNA 载体构建  66
    3.2.2 scrAAV-amiRNA 载体构建  66-67
    3.2.3 质粒大提  67
    3.2.4 细胞培养  67
    3.2.5 病毒生产  67-68
    3.2.6 病毒基因组提取  68
    3.2.7 Stem-loop miRNA RT-qPCR  68-69
    3.2.8 PAGE 蛋白电泳  69
    3.2.9 银染  69-71
    3.2.10 数据统计分析  71
  3.3 结果与分析  71-79
    3.3.1 成功构建 scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 质粒载体  71-72
    3.3.2 三质粒共转法包装 scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 病毒载体  72
    3.3.3 病毒滴度直接测定法的建立  72-76
    3.3.4 scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 病毒表征  76-77
    3.3.5 scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 对外源基因的表达  77-78
    3.3.6 scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 对靶基因的沉默效应  78-79
  3.4 结论  79-81
第4章 scrAAV-amiRNA 的优化与分析  81-106
  4.1 材料  81
    4.1.1 实验对象  81
    4.1.2 实验耗材  81
    4.1.3 实验试剂  81
    4.1.4 实验设备  81
  4.2 方法  81-87
    4.2.1 miRNA 深度测序表达谱数据整理  81-82
    4.2.2 主要 miRNA 及主要 pre-miRNA 数据组的建立  82
    4.2.3 成熟 miRNA 序列分类  82-84
    4.2.4 成熟 miRNA 序列分析  84
    4.2.5 主要 miRNA 的特征分析  84-85
    4.2.6 主要 pre-miRNA 的特征分析  85-86
    4.2.7 候选 miRNA 表达框的选择  86
    4.2.8 优化型 scrAAV-amiRNA 载体的构建  86
    4.2.9 病毒生产及质控  86
    4.2.10 amiRNA 定量分析  86
    4.2.11 数据统计分析  86-87
  4.3 结果与分析  87-103
    4.3.1 scrAAV-pcDNA6.2-amiRNA 不能高效表达 amiRNA  87
    4.3.2 成功构建覆盖范围广、重复性高的试验数据组  87-88
    4.3.3 成功构建主要 miRNA 数据组  88-89
    4.3.4 成功构建主要 pre-miRNA 数据组  89-90
    4.3.5 miRNA 成熟序列的系统分类结果  90-92
    4.3.6 不同物种间 miRNA 表达框的通用性分析  92-97
    4.3.7 确定候选 miRNA  97
    4.3.8 确定 miRNA 表达框的长度  97-99
    4.3.9 优化后的 scrAAV-opt-amiRNA 表达分析  99-100
    4.3.10 影响 scrAAV-amiRNA 表达性能因素分析  100-103
  4.4 结论  103-106
第5章 结论  106-110
  5.1 主要工作  106-107
  5.2 主要成果  107-108
  5.3 创新点  108
  5.4 局限性  108-109
  5.5 工作展望  109-110
参考文献  110-119
致谢  119-122
个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果  122-123

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