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hTERT靶向性amiRNA的筛选及其在scrAAV中的表达优化研究
作 者: 唐明青
导 师: 许瑞安
学 校: 华侨大学
专 业: 生物化工
关键词: RNA干扰 人工microRNA 人工microRNA载体 小RNA深度测序 表达框
分类号:
类 型: 博士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
研究背景:作为一种高效的基因调控手段,RNA干扰具有靶点专一、用量小等优点,被广泛应用于基因治疗等领域。传统的短发夹RNA载体虽然解决了常规小RNA短时效的缺点,但却伴随严重的细胞毒作用。基于內源microRNA的新一代人工microRNA载体(amiRNA)可以很好解决载体安全性问题,表达效率却不尽如人意。如何提高amiRNA载体的表达效率是目前小RNA载体急需解决的问题,amiRNA载体的优化工作对推动RNA干扰研究及其基因药物的发展意义重大。研究目的:本论文的主要目的是解决目前amiRNA载体表达中存在的瓶颈问题,获得高表达效率的新型amiRNA载体,加速小RNA基因药物的临床应用。研究方法:(1)利用Block-iT RNAi Designer软件设计靶向人端粒酶逆转录酶基因的amiRNA序列;(2)通过荧光定量、Western-Blot、Telochaser、细胞增殖、迁移、凋亡、血管生成、移植瘤实验来分析amiRNA的沉默效应和抗肿瘤活性;(3)借助报告基因沉默实验和基因芯片技术分析amiRNA的特异性和安全性;(4)依据miRNA引导序列的长度、指纹图谱、自由能等特征值差异来确定不同物种间miRNA表达框的通用性;(5)根据主要miRNA引导序列的表达丰度筛选出理论上具有高表达效率的表达框;(6)已验证的amiRNA序列、miRNA表达框和自身互补型腺相关病毒(scrAAV)通过重组产生scrAAV-amiRNA质粒载体;(7)三质粒共转法包装scrAAV-amiRNA病毒载体;(8)应用荧光定量和蛋白电泳技术对scrAAV-amiRNA病毒进行表征;(9)采用stem-loop RT qPCR来评价scrAAV-amiRNA病毒对目的amiRNA的表达效率;(10)使用小RNA深度测序来构建amiRNA成熟序列的表达图谱。研究结果:(1)成功筛选2条特异性抑制肿瘤细胞增殖、迁移与血管生成,促进肿瘤细胞凋亡、靶向人端粒酶逆转录酶基因的amiRNA序列;(2)以商品化表达框为基础的scrAAV-pcDNA6.2-amiRNA载体能表达目的amiRNA,但表达量低,沉默效应不显著;(3)不同物种间miRNA表达框的通用性跟物种间的进化关系相吻合;(4)优化后的scrAAV-opt-amiRNA载体表达效率最大提高近6倍;(5)scrAAV-opt-amiRNA表达的成熟序列多为异构序列,有效序列比例偏低。研究结论:(1)通过miRNA深度测序分析可以实现amiRNA载体的表达优化;(2)有效amiRNA成熟序列的含量是amiRNA载体表达优化的重要指标。
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全文目录
摘要 4-6 abstract 6-13 主要符号对照表 13-14 第1章 引言 14-35 1.1 研究意义 14-15 1.2 研究背景 15-30 1.2.1 RNA干扰 15-21 1.2.2 腺相关病毒 21-25 1.2.3 端粒酶 25-30 1.3 研究内容 30-31 1.4 方法路线 31-33 1.4.1 ami RNA的设计与筛选 31-32 1.4.2 scrAAV-amiRNA的构建与验证 32 1.4.3 scrAAV-amiRNA的优化与分析 32-33 1.5 论文结构 33-35 1.5.1 引言 33 1.5.2 amiRNA的设计与筛选 33 1.5.3 scrAAV-amiRNA的构建与验证 33 1.5.4 scrAAV-amiRNA的优化与分析 33 1.5.5 结论 33-35 第2章 amiRNA的设计与筛选 35-65 2.1 材料 35-37 2.1.1 实验对象 35 2.1.2 实验耗材 35 2.1.3 实验试剂 35-36 2.1.4 实验设备 36-37 2.2 方法 37-47 2.2.1 amiRNA的设计、合成、配制 37 2.2.2 细胞培养 37-38 2.2.3 amiRNA转染 38 2.2.4 siRNA 标记转染 38-39 2.2.5 RNA 提取 39 2.2.6 普通 RT-PCR 39-40 2.2.7 荧光定量 PCR 40 2.2.8 蛋白电泳 40-42 2.2.9 Western Blot 42-43 2.2.10 端粒酶活性测定 43-44 2.2.11 MTT 实验 44 2.2.12 流式细胞术 44 2.2.13 细胞凋亡染色 44-45 2.2.14 线粒体膜电位检测 45 2.2.15 Transwell 实验 45-46 2.2.16 小管生成实验 46 2.2.17 软琼脂克隆形成实验 46-47 2.2.18 amiRNA 靶点克隆沉默实验 47 2.2.19 裸鼠成瘤实验 47 2.2.20 数据统计分析 47 2.3 结果与分析 47-63 2.3.1 设计、合成 2 对最佳 amiRNA 序列 47-48 2.3.2 amiRNA 高效转染目的实验细胞 48-49 2.3.3 amiRNA 显著下调 hTERT 的表达 49-50 2.3.4 amiRNA 显著下调端粒酶活性 50-51 2.3.5 amiRNA 特异性改变 hTERT 阳性肿瘤细胞的形态 51-52 2.3.6 amiRNA 特异性抑制 hTERT 阳性肿瘤细胞的增殖 52-54 2.3.7 amiRNA 特异性促进 hTERT 阳性肿瘤细胞的凋亡 54-57 2.3.8 amiRNA 显著抑制细胞迁移和血管生成 57-58 2.3.9 amiRNA 有效降低 hTERT 阳性肿瘤细胞的成瘤能力 58-60 2.3.10 amiRNA-hTERT 主要通过影响 P53 信号通路发挥作用 60-62 2.3.11 amiRNA 的特异性与安全性 62-63 2.4 结论 63-65 第3章 scrAAV-amiRNA 的构建与验证 65-81 3.1 材料 65-66 3.1.1 实验对象 65 3.1.2 实验耗材 65 3.1.3 实验试剂 65 3.1.4 实验设备 65-66 3.2 方法 66-71 3.2.1 pcDNA6.2-amiRNA 载体构建 66 3.2.2 scrAAV-amiRNA 载体构建 66-67 3.2.3 质粒大提 67 3.2.4 细胞培养 67 3.2.5 病毒生产 67-68 3.2.6 病毒基因组提取 68 3.2.7 Stem-loop miRNA RT-qPCR 68-69 3.2.8 PAGE 蛋白电泳 69 3.2.9 银染 69-71 3.2.10 数据统计分析 71 3.3 结果与分析 71-79 3.3.1 成功构建 scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 质粒载体 71-72 3.3.2 三质粒共转法包装 scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 病毒载体 72 3.3.3 病毒滴度直接测定法的建立 72-76 3.3.4 scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 病毒表征 76-77 3.3.5 scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 对外源基因的表达 77-78 3.3.6 scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 对靶基因的沉默效应 78-79 3.4 结论 79-81 第4章 scrAAV-amiRNA 的优化与分析 81-106 4.1 材料 81 4.1.1 实验对象 81 4.1.2 实验耗材 81 4.1.3 实验试剂 81 4.1.4 实验设备 81 4.2 方法 81-87 4.2.1 miRNA 深度测序表达谱数据整理 81-82 4.2.2 主要 miRNA 及主要 pre-miRNA 数据组的建立 82 4.2.3 成熟 miRNA 序列分类 82-84 4.2.4 成熟 miRNA 序列分析 84 4.2.5 主要 miRNA 的特征分析 84-85 4.2.6 主要 pre-miRNA 的特征分析 85-86 4.2.7 候选 miRNA 表达框的选择 86 4.2.8 优化型 scrAAV-amiRNA 载体的构建 86 4.2.9 病毒生产及质控 86 4.2.10 amiRNA 定量分析 86 4.2.11 数据统计分析 86-87 4.3 结果与分析 87-103 4.3.1 scrAAV-pcDNA6.2-amiRNA 不能高效表达 amiRNA 87 4.3.2 成功构建覆盖范围广、重复性高的试验数据组 87-88 4.3.3 成功构建主要 miRNA 数据组 88-89 4.3.4 成功构建主要 pre-miRNA 数据组 89-90 4.3.5 miRNA 成熟序列的系统分类结果 90-92 4.3.6 不同物种间 miRNA 表达框的通用性分析 92-97 4.3.7 确定候选 miRNA 97 4.3.8 确定 miRNA 表达框的长度 97-99 4.3.9 优化后的 scrAAV-opt-amiRNA 表达分析 99-100 4.3.10 影响 scrAAV-amiRNA 表达性能因素分析 100-103 4.4 结论 103-106 第5章 结论 106-110 5.1 主要工作 106-107 5.2 主要成果 107-108 5.3 创新点 108 5.4 局限性 108-109 5.5 工作展望 109-110 参考文献 110-119 致谢 119-122 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果 122-123
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