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人类PIF1解螺旋酶的功能研究

作　者: 赵德根
导　师: 顾永清
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: PIF1 敲低细胞系重组质粒过表达细胞系 DNA损伤
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：PIF1基因被普遍认为是辐射敏感型的基因，通过研究PIF1基因参与电离辐射诱导的DNA损伤修复，来探讨PIF1基因参与DNA损伤修复的分子机制。利用RNA干扰技术“敲低”PIF1全长基因，进一步的研究PIF1解螺旋酶的生理功能。构建三种重组质粒，用脂质体转染法将其分别转染到HeLa细胞中来筛压稳转过表达的细胞系，用于对PIF1基因的更深入的研究。方法：对培养的HeLa细胞进行不同剂量的γ射线照射，用Western blot和Real-Time PCR来检测PIF1基因的表达量的变化，从变化中来了解和研究PIF1基因在DNA损伤修复中可能存在的功能。利用RNA干扰技术“沉默”PIF1全长基因，通过Western blot和Real-Time PCR来检测敲低细胞PIF1基因的敲低效果。观察敲低的细胞系与野生型细胞系在生长状态上的差异.对敲低的细胞系进行不同剂量的γ射线照射，通过活细胞计数了解细胞的增殖能力，流式细胞仪测细胞周期，克隆形成率等实验来观察敲低细胞株与野生型细胞株在γ射线照射前后细胞的生存能力、DNA损伤修复情况及细胞周期变化情况。从pCR2.1-TOPO-PIF1原始质粒中，利用PCR方法扩增目的基因PIF1、PIF1N及PIF1C，将目的基因和目的载体pcDNA3.1（-）分别酶切定向连接，构建出三种重组质粒【PcDNA3.1（-）-PIF1、PcDNA3.1（-）-PIF1N、PcDNA3.1（-）-PIF1C】。通过脂质体转染法将这三种重组质粒分别转染到HeLa细胞中，筛压稳转过表达的细胞系。结果：1. HeLa细胞经不同剂量的γ射线处理后通过Western blot检测发现PIF1蛋白表达量在不同时间点有先降低后升高的趋势，用Real-Time PCR的方法检测发现PIF1基因在mRNA水平上也出现不同时间点有先降低后升高的趋势。2.通过Western blot和Real-Time PCR的方法检测出敲低的细胞系与对照细胞相比较在转录与翻译水平上都有不同程度的敲低现象。对敲低的细胞系进行不同剂量的γ射线照射处理后，活细胞计数发现Sh-PIF1-Hela敲低细胞比Sh-NC-Hela对照细胞的生长速度要慢很多且细胞凋亡增加。克隆形成率实验发现随着细胞照射剂量的增加，细胞的增殖能力降低，形成克隆数减少，敲低细胞与对照细胞相比，细胞的生存能力降低。流式细胞仪测细胞周期发现敲低细胞G2/M期阻滞明显延长。3.成功构建出三种重组质粒，并对其转染的三种过表达的细胞系，通过Western blot法并没有检测出PIF1蛋白表达量的升高，但用Real-TimePCR的方法测出PcDNA3.1-PIF1全长和PcDNA3.1-PIF1C端的mRNA相对表达量都有一定程度的增加，而PcDNA3.1-PIF1N端的mRNA的相对表达量并没有增加。是否构建出稳转的细胞系有赖于进一步的实验验证。结论1. PIF1基因具有辐射敏感性，与DNA损伤修复相关。2.成功的构建出稳转敲低的细胞系（Sh-PIF1-Hela）。发现PIF1基因与凋亡密切相关。3.成功的构建出三种重组质粒。

全文目录

目录  5-6
摘要  6-7
Abstract  7-9
主要英文缩略语索引  9-10
前言  10-14
材料与方法  14-28
  1 材料  14-17
  2 方法  17-27
  3 统计分析  27-28
结果  28-40
讨论  40-42
结论  42-43
参考文献  43-46
文献综述  46-53
  参考文献  50-53
致谢  53-54
作者简介  54-55
导师审阅表  55

人类PIF1解螺旋酶的功能研究

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