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板蓝根多糖化学结构及佐剂活性的研究
作 者: 朱婷
导 师: 赵毅民
学 校: 中南大学
专 业: 药学
关键词: 板蓝根 多糖 结构 佐剂活性 提取工艺
分类号: R286
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
板蓝根是我国常用传统中药材,为十字花科植物菘蓝(IsatisIndigotica)根,具有清热解毒、凉血利咽之功效,常用于治疗温热病等,是传统的抗病毒中药之一。本课题前期研究表明板蓝根总多糖(IIP)对OVA筛选抗原具有明显佐剂活性。总多糖经DEAE纤维素柱层析得到IIP-A.IIP-B.IIP-C和IIP-D组分,其中IIP-A和IIP-B能显著提高H1N1流感疫苗的抗体滴度。IIP-A中主要佐剂活性成分IIP-1是一种α-葡聚糖,分子量为3600Da。本论文拟对活性组分IIP-B进行系统化学分离和佐剂活性追踪,阐明活性多糖的理化性质和结构特点。本文首先对板蓝根总多糖的提取工艺及影响因素进行考察。采用三因素三水平正交试验设计,考察温度、液料比和提取次数对总多糖得率、糖含量、分子量分布以及单糖组成的影响,同时考察提取温度对总多糖理化性质的影响。实验结果表明:影响总多糖得率的因素次序为提取温度>液料比>提取次数,提取温度是最大影响因素。单因素考察结果显示随着提取温度的升高,总多糖得率、大分子多糖以及总多糖中葡萄糖相对摩尔比均显著增加,而其中二种活性多糖含量明显减少,特别是提取温度≥70℃效果更显著。最终确定总多糖的最佳提取工艺为:温度≤60℃,液料比15:1,提取2次。其次本文采用Sephadex G-100凝胶柱层析将组分IIP-B分为IIP-B-1和IIP-B-2二个亚组分。IIP-B-1和IIP-B-2再经Sephadex G-100柱层析纯化,分别得到具有佐剂活性的均一多糖IIP-2和IIP-4。IIP-2的峰高分子量为6400Da,主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成,摩尔比为1.0:12.6:1.0。IIP-2的主要骨架为:1→)Glc(→3,6和→1)Glc(→2,3,4;半乳糖的连接方式有→1)Gal(→3和→1)Gal(6→,阿拉伯糖的连接方式有→1)Araf(→2和→1)Arafo IIP-4主要是由阿拉伯糖和半乳糖组成,摩尔比为1:1.5。IIP-4的主要骨架片段为→1)Gal(3,6→,同时还有→1)Araf、→1)Araf(5→和→1)Gal(6→等连接片段。多糖IIP-2和IIP-4按100μg/鼠剂量与H1N1抗原(H1N1病毒裂解液,3μg/鼠)联用,肌肉注射免疫Balb/C小鼠一次,免疫2周后采用ELASI方法测定特异性抗体滴度及抗体亚型滴度。实验结果表明与单独抗原或盐水免疫组相比,IIP-2和IIP-4能显著提高小鼠H1N1抗原的特异性抗体滴度(p<0.01)。IIP-4按150μg/鼠剂量与乙肝抗原(乙肝蛋白亚单位,2μg/鼠)联用免疫小鼠二次,免疫后2周测定特异性抗体滴度。结果显示多糖IIP-4能显著提高乙肝抗原的抗体滴度,佐剂活性优于铝佐剂。提示板蓝根多糖IIP-2和IIP-4对H1N1流感抗原和乙肝抗原均有显著佐剂活性,可以作为预防疫苗和治疗疫苗的候选佐剂。
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全文目录
摘要 4-6 Abstract 6-8 英文缩略词表 8-12 1 绪论 12-19 1.1 免疫佐剂概念 12 1.2 疫苗佐剂分类 12-14 1.2.1 微生物成分佐剂 12 1.2.2 不溶性盐类佐剂 12 1.2.3 油乳佐剂 12-13 1.2.4 免疫刺激复合物(ISCOM)与糖苷 13 1.2.5 分子佐剂 13 1.2.6 脂质体佐剂 13 1.2.7 多糖类佐剂 13 1.2.8 其他佐剂 13-14 1.3 均一多糖佐剂的研究 14-15 1.3.1 壳聚糖 14 1.3.2 葡聚糖 14 1.3.3 阿拉伯半乳聚糖 14-15 1.3.4 甘露聚糖 15 1.4 板蓝根多糖制备工艺及化学成分的研究 15-17 1.4.1 多糖提取工艺的研究 15-16 1.4.2 多糖化学成分的研究 16-17 1.5 板蓝根在疫苗佐剂中的应用 17-19 1.5.1 板蓝根多糖 17-18 1.5.2 其他板蓝根成分 18-19 2 板蓝根总多糖提取工艺的研究 19-36 2.1 材料 19 2.1.1 药材与试剂 19 2.1.2 仪器 19 2.2 实验方法 19-23 2.2.1 板蓝根总多糖的提取流程 19-21 2.2.2 正交试验设计 21 2.2.3 单因素温度对板蓝根总多糖提取影响考察 21-22 2.2.4 总多糖的糖含量测定(硫酸-苯酚法) 22 2.2.5 板蓝根多糖的糖醛酸含量测定(问羟联苯法) 22 2.2.6 多糖分子量分布的测定 22-23 2.2.7 单糖组成分析(GC) 23 2.3 实验结果 23-34 2.3.1 水提正交试验结果 23-27 2.3.2 温度对总多糖得率、糖含量、糖醛酸含量的影响 27-28 2.3.3 温度对总多糖分子量分布及活性多糖的影响 28-31 2.3.4 温度对总多糖单糖组成的影响 31-34 2.4 本章小结 34-36 3 板蓝根活性多糖IIP-B组分的理化性质研究 36-44 3.1 材料 36-37 3.1.1 药材与试剂 36 3.1.2 仪器 36-37 3.2 实验方法 37-38 3.2.1 IIP-B的分离和纯化流程 37 3.2.2 比旋光度测定 37 3.2.3 糖含量测定(硫酸-苯酚法) 37-38 3.2.4 糖醛酸含量的测定(间羟联苯法) 38 3.2.5 分子量测定以及多糖的均一性 38 3.2.6 单糖组成分析(GC) 38 3.3 实验结果 38-43 3.3.1 IIP-B的分离和得率 38-39 3.3.2 IIP-B-1的进一步的分离纯化 39 3.3.3 IIP-B-2的进一步的分离纯化 39-40 3.3.4 IIP-2、IIP-4的比旋光度 40 3.3.5 IIP-2 IIP-4纯度鉴定及分子量测定 40-42 3.3.6 GC法测定单糖组成 42-43 3.4 小结 43-44 4 多糖IIP-2IIP-4化学结构的研究 44-62 4.1 材料 44-45 4.1.1 试剂 44 4.1.2 仪器 44-45 4.2 实验方法 45-49 4.2.1 外吸收光谱测定(IR) 45 4.2.2 核磁共振(NMR)图谱测定 45 4.2.3 高碘酸氧化反应 45-46 4.2.4 Smith降解反应 46-48 4.2.5 甲基化反应(Ciucann改良法) 48-49 4.3 实验结果 49-60 4.3.1 IIP-2结构解析 49-55 4.3.2 IIP-4结构解析 55-60 4.4 小结 60-62 5 IIP-B活性多糖组分佐剂活性评价 62-71 5.1 材料 62-63 5.1.1 供试品与试剂 62-63 5.1.2 仪器 63 5.1.3 动物 63 5.2 实验方法 63-66 5.2.1 试剂的配制 63 5.2.2 H1N1抗原免疫方案 63-64 5.2.3 H1N1抗原免疫的特异性抗体滴度测定方法 64 5.2.4 ELISA法检测血清H1N1抗体亚类方法 64-65 5.2.5 肝抗原免疫方案 65 5.2.6 ELISA法检测血清HBsAg特异性抗体滴度 65-66 5.2.7 ELISA法检测血清HBsAg特异性抗体亚类 66 5.2.8 统计方法 66 5.3 实验结果 66-70 5.3.1 IIP-1、IIP-2和IIP-4对H1N1抗原免疫的抗体滴度及亚类的影响 66-68 5.3.2 IIP-1和IIP-4对乙肝抗原免疫的抗体滴度及亚类的影响 68-70 5.4 小结 70-71 参考文献 71-76 攻读学位期间主要的研究成果 76-82 致谢 82
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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药品
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