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重组日本七鳃鳗rLj-RGD2与其4种突变体蛋白对Lewis细胞生物活性的比较

作　者: 刘洋
导　师: 王继红
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 日本七鳃鳗 RGD模体肿瘤细胞基因突变
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

Lj-RGD2含有两个RGD模体,分子质量为8kD,是来自于日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白,具有典型RGD毒素蛋白的特征。为了研究Lj-RGD2的结构与其功能具有怎样的关系,本文采用基因突变的方法,对野生型Lj-RGD2进行基因突变,即对其具有功能的RGD模体进行缺失突变,因为Lj-RGD2基因的重复序列较多,无法执行定点突变,故合成其突变体的全基因序列,以pET23b作为其突变体的载体,用CaCl₂转化法转入表达菌E.coil BL21中。Lj-RGD2的突变体包括：缺失第一个RGD基因,保留第二个RGD基因的突变体Lj-738；缺失第二个RGD基因,保留第一个RGD基因的突变体Lj-739；缺失两个RGD基因的突变体Lj-740；将两个RGD基因全部突变为KGD基因的突变体Lj-741。本课题对野生型和突变后的4个突变体类型进行了部分生物学活性的比较,从而确定其结构与功能的关系。具体流程为：载有突变体全序列基因的pET23b转化到表达菌E.coil BL21中,IPTG诱导带有目的基因的表达菌表达目的蛋白,经组氨酸亲和层析获得纯化的可溶性目的蛋白。获得的可溶性目的蛋白,分别作用于Lewis细胞,从而鉴定他们的生物学活性。细胞增殖实验（MTT法）结果表明,rLj-RGD2和其4个突变体蛋白均以剂量依赖方式抑制bFGF诱导的Lewis细胞的增殖,rLj-RGD2、 rLj-738、rLj-73、 rLj-740、 rLj-741的IC50值分别为1.23μmol/L、1.11μmol/L.1.18μmol/L、1.03μmol/L；通过Transwell细胞培养板检测rLj-RGD2及其4种突变体蛋白对由bFGF诱导的Lewis细胞迁移的抑制作用,其结果表明,rLj-RGD2及其4种突变体蛋白rLj-738、 rLj-739、 rLj-740、 rLj-741均能抑制Lewis细胞的迁移,抑制率分别为30%、31%、31%、34%、25%；将人工基质膜Matrigel固定到Transwell培养板的多聚碳酸盐膜上以模仿体内环境,从而研究rLj-RGD2与4种突变体蛋白对Lewis细胞浸润的抑制作用,结果显示,rLj-RGD2及其4种突变体蛋白均能抑制由bFGF诱导的Lewis细胞穿透Matrigel的浸润行为,抑制率为22%、24%、32%、32%、24%；rLj-RGD2及其4种突变体蛋白对Lewis细胞骨架均有破坏作用；rLj-RGD2及其4种突变体蛋白均能诱导Lewis细胞的凋亡；对rLj-RGD2及其4种突变体蛋白作用于Lewis细胞的作用机理进行了初步的研究,结果表明rLj-RGD2及其4种突变体蛋白都能下调FAK、 ILK表达及FAK磷酸化水平。上述结果表明,rLj-RGD2抗Lewis肿瘤细胞的功能既与RGD模体也与富组氨酸结构相关,其中涉及的作用机制可能并不相同。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-6
目录  6-9
引言  9-10
第一章文献综述  10-20
  1.1 整合素活性、亲和力的变化对细胞迁移的影响及作用机制  10-15
    1.1.1 细胞迁移中整合素活性与亲和力的变化  10-11
    1.1.2 调节整合素亲和力的信号分子  11-12
    1.1.3 细胞定向移动后缘解黏附涉及的信号分子  12-13
    1.1.4 细胞迁移与整合素信号转导通路的关系  13-15
    1.1.5 整合素通过对基质金属蛋白酶类的调节影响细胞迁移  15
  1.2 整合素介导的细胞增殖  15-17
  1.3 整合素与细胞凋亡的关系  17-18
  1.4 整合素和体内浸润性生长的关系  18-20
第二章野生型rLj-RGD2及其突变体rLj-738、rLj-739、rLj-740、rLj-741的基因合成与蛋白的诱导表达、纯化及鉴定  20-32
  2.1 材料及试剂  20
  2.2 方法  20-25
    2.2.1 4个突变体目的基因的合成  20
    2.2.2 提取4个突变体目的基因质粒  20-21
    2.2.3 琼脂糖凝胶电泳  21
    2.2.4 重组质粒转化到E.coli BL21表达菌中  21-22
    2.2.5 提取阳性转化菌的质粒并做基因测序检验  22
    2.2.6 对4种突变体菌进行不同时间和温度梯度的IPTG诱导  22-23
    2.2.7 4种突变体蛋白的表达及纯化  23-24
    2.2.8 Tricine-SDS PAGE电泳  24-25
    2.2.9 考马斯亮蓝G-250法测定纯化蛋白浓度  25
  2.3 结果  25-30
    2.3.1 野生型Lj-RGD2氨基酸序列及序列比对分析  25-26
    2.3.2 突变体Lj-738、Lj-739、Lj-740以及Lj-741的cDNA序列合成及其推导的氨基酸序列  26-28
    2.3.3 目的基因质粒的提取及目的基因表达菌的转化  28
    2.3.4 基因重组蛋白rLj-RGD2、rLj-738、rLj-739、rLj-740以及rLj-741进行IPTG的诱导表达  28-29
    2.3.5 基因重组蛋白rLj-RGD2、rLj-738、rLj-739、rLj-740以及rLj-741的纯化及鉴定  29
    2.3.6 绘制蛋白标准曲线及蛋白质浓度的测定  29-30
  2.4 讨论  30-31
  2.5 结论  31-32
第三章野生型rLj-RGD2及其突变体rLj-738、rLj-739、rLj-740、rLj-741对Lewis细胞生物活性及部分机制的研究  32-51
  3.1 材料及试剂  32
  3.2 方法  32-37
    3.2.1 细胞培养  32
    3.2.2 细胞增殖实验  32-33
    3.2.3 Lewis细胞的迁移实验  33
    3.2.4 Lewis细胞的浸润实验  33-34
    3.2.5 rLj-RGD2及其4种突变体蛋白对Lewis细胞骨架的作用  34
    3.2.6 rLj-RGD2及其4种突变体蛋白对Lewis细胞凋亡的作用  34-35
    3.2.7 蛋白质免疫印迹(Western Blot)  35-37
  3.3 结果  37-48
    3.3.1 rLj-RGD2及其4种突变体蛋白对由bFGF诱导的Lewis细胞增殖的抑制作用  37-39
    3.3.2 Lewis细胞的迁移实验  39-41
    3.3.3 Lewis细胞的浸润实验  41-42
    3.3.4 rLj-RGD2及其4种突变体蛋白对Lewis细胞骨架的作用  42-45
    3.3.5 rLj-RGD2及其4种突变体蛋白对Lewis细胞凋亡的作用  45-46
    3.3.6 rLj-RGD2及其4种突变体蛋白对Lewis细胞作用机理的初步研究  46-48
  3.4 讨论  48-50
  3.5 结论  50-51
结论  51
本论文的创新点  51
需要进一步研究的问题  51-52
参考文献  52-57
附录A Lj-RGD2、Lj-738、Lj-739、Lj-740、Lj-741基因与载体pET-23b连接示意图  57-58
附录B 突变体Lj-738、Lj-739、Lj-740、Lj-741基因测序结果图  58-62
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  62-63
致谢  63

重组日本七鳃鳗rLj-RGD2与其4种突变体蛋白对Lewis细胞生物活性的比较

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