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去甲泽拉木醛的免疫抑制作用及药代动力学研究

作　者: 许文平
导　师: 林宗明
学　校: 复旦大学
专　业: 外科学
关键词: 雷公藤 免疫抑制 肾移植 三萜单体 动物模型 药代动力学
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook. f., TWHF)系卫矛科雷公藤属多年生藤本植物,其化学成分主要是二萜、三萜、倍半萜、生物碱等。雷公藤的免疫抑制作用早已被认识,并被用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫疾病且效果显著。从雷公藤的根皮提取的雷公藤多苷已上市并用于临床。雷公藤三萜为五环三萜,是目前研究的热点,研究发现雷公藤三萜具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗肿瘤和免疫调节等活性。我们课题组从雷公藤中分离到一种分子量为480,分子式C29H3606的酚性去甲基三萜化合物,定名为去甲泽拉木醛(Demethylzeylasteral, T-96)。前期研究表明T-96是通过抑制T细胞的转化,主要是抑制淋巴细胞白介素2(IL-2)的生成和释放,降低IL-2的受体活性而起作用的,所以T-96可能是具有高免疫抑制性,低骨髓抑制的药物。本论文继续利用体内外免疫实验和大动物模型研究T-96的免疫抑制作用,研究其在比格犬内的药物代谢动力学,将T-96开发成为中药1类新药,应用于器官移植和自身免疫性疾病。第一部分T-96体内外的免疫抑制作用实验目的：对T-96在体外、体内对免疫系统的影响作用进行研究。检测T-96对淋巴细胞毒性、增殖反应的作用,对淋巴细胞产生细胞因子的作用,对细胞介导免疫反应和特异性体液免疫功能的影响。方法：在体外实验系统中,通过MTT法和3H法,检测T-96对淋巴细胞毒性、增殖反应的作用,利用ELISA法检测T-96对淋巴细胞产生细胞因子的作用；在体内实验系统中,利用二硝基氟苯诱导的迟发性超敏反应(delayed-type hypersensitivity, DTH),检测T-96对细胞介导免疫反应的影响作用,通过抗羊红细胞特异性抗体的产生,总抗体IgG产生,检测T-96对特异性体液免疫功能的影响。结果：T-96在1μ/ml以下的浓度对淋巴细胞没有明显的细胞毒性作用,而在此浓度以下时,仍有抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖反应的活性作用,且其作用随着浓度降低而减弱,最低有效浓度为0.0001μg/ml。T-96与CsA的免疫抑制作用相似,选择性地抑制T淋巴细胞功能。T-96在没有淋巴细胞毒性的浓度1μg/ml时,对APC和T淋巴细胞分泌的细胞因子有明显的调节活性作用。在ConA刺激诱导产生T细胞的细胞因子实验中,T-96在没有淋巴细胞毒性的浓度1μg/ml时,对T细胞分泌的细胞因子IL-2有一定的抑制活性作用。在DNFB诱导的DTH实验中,0.1mg/kg的T-96有明显的抑制细胞介导免疫的DTH反应。T-96的急毒实验的半数致死量LDs0为>30mg/kg。腹腔给药T-96(0.1mg/kg-10mg/kg)时,对脾B细胞抗羊红细胞特异性抗体生成在有促进作用。结论：以上结果表明,T-96的免疫抑制作用与雷公藤甲素的细胞毒作用机制所致免疫抑制效应有着明显的不同,T-96的这种抑制作用可能通过作用于免疫反应的环节而获得,而不是直接的细胞毒性作用引起。T-96抑制免疫反应的作用比雷公藤甲素的作用更强,在达到一定浓度时,其抑制作用强度甚至与CsA相当。第二部分建立同种异体比格犬肾移植模型目的：建立一种可靠方便的同种异体比格犬肾移植模型,为进一步开展T-96的药效学研究提供大动物模型。方法：实验犬随机分成伪手术组和移植组两个组,每组6条犬。伪手术组摘除右肾,保留左肾。移植组为6只成年、健康肾移植犬,两两配对,互为受供体。观察两组比格犬术后血肌酐、尿素氮和一般情况变化。结果：比格犬肾移植模型稳定,移植犬从术后第3天血肌酐和尿素氮明显升高,血肌酐从术前的71.17±7.52μ mol/L上升到术后第6天的1026.4±110.06u mol/L,尿素氮从术前的4.38±0.75mmol/L上升到术后第6天的42.08±5.58mmol/L。伪手术组血肌酐和尿素氮则一直稳定维持稳定。移植组一般情况方面,有5只受体犬术后存活,状态良好,行动自如。有1只犬术后第一天精神略萎靡,可能为麻醉时间过长引起,术后第二天也可自行站立行走。病理切片发现典型的急性移植反应。结论：建立了一种稳定、方便的同种异体比格犬肾移植模型,为开展T-96的药效学研究提供大动物模型,也可广泛用于移植免疫学和免疫药物的筛选研究。第三部分T-96在比格犬肾移植模型的免疫抑制作用目的：利用第四部分建立的同种异体比格犬肾移植模型,进一步研究T-96的药效学,评价T-96在比格犬肾移植模型中的免疫抑制作用。方法：实验犬随机分成六个组,每组6条犬。肾移植犬,两两配对,互为受供体。肾移植对照组,在犬肾移植术后第一天起,每天给予生理盐水灌胃(n=6)；CsA用药组,术后第一天起,每天给予比格犬CsA5mg/kg喂药一次(n=6)；低剂量T-96用药组,术后第一天起,每天给予比格犬T-965mg/kg喂药一次(n=6)；中剂量T-96用药组,术后第一天起,每天给予比格犬T-9610mg/kg喂药一次(n=6)；高剂量T-96用药组,术后第一天起,每天给予比格犬T-9620mg/kg喂药一次(n=6)；T-96和CsA联合用药组,术后第一天起,每天给予比格犬T-9610mg/kg+CsA5mg/kg喂药一次(n=6)。结果：T-9610mg/kg可延长移植犬生存期至10.83±1.47d和对照组6.33±1.21d相比有统计学意义(P<0.05)。T-9620mg/kg可延长移植犬生存期至11.17±1.47d和对照组6.33±1.21d相比有统计学意义(P<0.05)。T-9610mg/kg和CsA5mg/kg可延长犬生存时间至13.33±1.75d,与单用CsA5mg/kg组10.67±1.63d相比,有统计学意义(P<0.05)。结论：T-96有抑制比格犬肾移植急性排斥作用,且抑制作用随着剂量的增大而增强,T-96与CsA联用更能延长比格犬肾移植存活时间。第四部分建立比格犬血浆T-96的LC-MS/MS测定方法目的：建立比格犬血浆样品中T-96的LC-MS/MS (液相色谱-质谱-质谱联用技术)测定方法,评价该方法的准确度、精密度、灵敏度、专属性及定量线性等是否符合生物样品的分析要求,是否可用于比格犬体内T-96的药代动力学研究。方法：通过制备T-96的血浆标准曲线,研究T-96的LC-MS/MS测定分析方法的专属性、考察精密度和回收率,考察分析方法的绝对回收率,考察分析样品基质效应和稳定性和考察分析方法的稀释效应等方面,评价T-96的该测定方法。结果：本实验建立的比格犬血浆样品中T-96的LC-MS/MS测定方法,血浆内源性物质均不干扰样品峰,血浆中T-96的相对回收率大于85%,日间和日内相对标准差小于5%,最低定量限为2.02ng/ml,线性范围为2.02-505ng/mL结论：比格犬血浆样品中T-96的LC-MS/MS测定方法的准确度、精密度、灵敏度、专属性及定量线性等均符合生物样品的分析要求,可用于比格犬体内T-96的药代动力学研究。第五部分T-96在比格犬体内的药物代谢动力学研究目的：利用第二部分建立的比格犬血浆样品中T-96的LC-MS/MS测定方法,研究和评价比格犬体内T-96的药代动力学特征。方法：采用用LC-MS/MS测定方法,研究比格犬单剂量口服给药T-96原料药20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg后体内药代动力学；研究比格犬前肢静脉注射T-96注射液5mg/kg后体内药代动力学。利用非房室模型法估算T-96药时曲线的末端相消除半衰期(t1/2)、平均驻留时间(MRT)、峰浓度(Cmax)、峰时间(tmax)、AUC0-24、AUC0～∞,并估算口服T-96原料药40mg/kg相对于静注T-96注射液5mg/kg的绝对利用度。结果：经非房室模型法估算6条比格犬单剂量口服给药T-96原料药20mg/kg (40、80mg/kg)后T-96药时曲线的末端相消除半衰期(t1/2)、峰浓度(Cmax)、峰时间(tmax)、 AUC0-24、 AUC0-∞分别为10.75±1.14h(11.70±1.21h,11.20±1.43h),418.42±73.61ng/ml (842.49±99.43ng/ml,1383.61±143.05ng/ml),8.7±1.0h (11.70±1.1h,10.7±1.0h),7691.96±2361.70ng·h/ml (16225.59±3081.34ng-h/ml,26027.86±5150.72ng·h/ml),7788.33±2365.32ng-h/ml (16553.42±3289.75ng-h/ml,26517.20±5461.39ng-h/ml)。经非房室模型法估算6条比格犬单剂量静注给药T-96原料药注射液5mg/kg后T-96药时曲线的末端相消除半衰期(t1/2)、平均驻留时间(MRT)、给药后即时血药浓度(Co)、清除率(ClT)、表观分布容积(VD)、 AUC0-12. AUC0-∞分别为9.85±0.76h、6.94±1.65h、47701.35±2559.10ng/ml、0.10±0.03L/h/Kg、0.74±0.39L/Kg、54615.76±19147.38ng·h/ml54786.26±19161.47ng-h/ml。结论：以6条成年健康比格犬静注给药T-96原料药注射液5mg/kg为参比,剂量校正后,用梯形面积法(AUC)估算口服给药T-96原料药40mg/kg相对于静注给药T-96原料药注射液5mg/kg的的绝对生物利用度为4.2%±1.9%(2.3%～6.1%)。

全文目录


中文摘要  5-9
Abstract  9-14
前言  14-17
第一部分 T-96体内外的免疫抑制作用实验  17-36
  前言  17-18
  实验材料  18-19
  实验方法  19-22
  实验结果  22-33
  讨论  33-35
  第一部分创新点和意义  35-36
第二部分 建立同种异体比格犬肾移植模型  36-50
  前言  36-37
  材料和方法  37-42
  结果  42-48
  讨论  48-50
第三部分 T-96在比格犬肾移植模型的免疫抑制作用  50-65
  前言  50
  材料和方法  50-56
  结果  56-62
  讨论  62-64
  第三部分创新点和意义  64-65
第四部分 建立比格犬血浆T-96的LC-MS/MS测定方法  65-79
  前言  65
  实验材料  65-66
  方法和结果  66-78
  讨论  78-79
第五部分 T-96在比格犬体内的药物代谢动力学研究  79-98
  前言  79
  实验材料  79-80
  方法和结果  80-95
  讨论  95-97
  第五部分创新点和意义  97-98
总结和展望  98-100
参考文献  100-106
综述  106-115
  参考文献  111-115
英文缩略词表  115-116
附录  116-119
  在校期间参与的课题及会议  116-117
  在校期间发表的文章  117-118
  在校期间所获得的奖励  118-119
致谢  119-121

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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