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藜芦人参合用对HepG2细胞的增毒效应及肝药酶定量方法的建立

作　者: 陆亚丽
导　师: 蔡耘
学　校: 中南大学
专　业: 药学
关键词: HepG2细胞 十八反 药物代谢酶 QconCAT MRM
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 19次
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内容摘要


目的在HepG2细胞水平上评价藜芦与人参合用增毒模型,探讨其增毒是否基于细胞色素P450的药物相互作用引起。建立药代酶浓度快速测定方法,用于规模化筛选“十八反”各药物在体内影响的靶药代酶谱。方法通过细胞存活率、细胞形态学改变、乳酸脱氢酶释放率和细胞凋亡比例这些指标考察藜芦单用和藜芦人参合用后对HepG2细胞的毒性；用不同浓度的人参水提液作用于HepG2细胞,采用qRT-PCR法检测人参对细胞色素P450的mRNA表达的影响。构建包含41个肝药酶的4个QconCAT质粒,以QconCAT质粒重标培养表达酶切产生的标记肽段为内标,对人肝微粒体中的肝药酶进行基于MRM的绝对丰度检测。结果藜芦与人参合用的IC50值(15.18±1.03)mg/mL与藜芦单用的IC50值(21.46±1.10)mg/mL相比,对HepG2细胞增殖抑制作用更明显；藜芦人参低、中、高剂量配伍组比相同剂量藜芦单用组对细胞膜的破坏更严重；流式细胞术检测表明在中高剂量时合用比单用更能引起晚凋和坏死。人参对CYP3A4、CYP1A1、CYP1A2、CYP2E1、 CYP2B6mRNA表达有调控作用。建立了肝药酶丰度检测的方法,GST肽段在复杂基质中的回收率大于90%,重复性<25%,QconCAT肽段的动态范围达到2个数量级,线性大于0.98,符合方法学要求。用该方法检测到的混合人肝微粒体中的肝药酶共27个,丰度在2.83fmol/μg微粒体到161.66fmol/μg微粒体之间,技术重复性与生物学重复性CV<25%,符合实际应用需求。结论藜芦与人参合用细胞毒性明显增加,且人参对其中一些参与藜芦定碱代谢的CYP亚型有明确的调控作用,因此二者可能存在基于药物代谢酶机理的相反作用。同时,建立了蛋白质组学的方法检测肝药酶丰度,实现药物对肝药酶丰度调控检测方法的一个飞跃。图11幅,表11个,参考文献39篇

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
符号说明  9-10
1 绪论  10-13
2 藜芦人参合用对HepG2细胞的增毒评价  13-21
  2.1 实验材料  13
    2.1.1 试剂  13
    2.1.2 仪器  13
  2.2 实验方法  13-15
    2.2.1 CCK-8法检测细胞增殖  13-14
    2.2.2 LDH释放实验  14
    2.2.3 培养细胞的HE染色  14-15
    2.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡  15
  2.3 实验结果  15-19
    2.3.1 细胞抑制作用  15-16
    2.3.2 细胞LDH释放率  16
    2.3.3 细胞形态  16-18
    2.3.4 细胞凋亡  18-19
  2.4 讨论  19-21
3 人参对HepG2细胞CYPmRNA表达的调控作用  21-27
  3.1 实验材料  21
    3.1.1 试剂  21
    3.1.2 仪器  21
  3.2 实验方法  21-23
    3.2.1 提取RNA  21-22
    3.2.2 反转录  22-23
    3.2.3 荧光实时定量PCR  23
  3.3 实验结果  23-26
  3.4 讨论  26-27
4 肝药酶定量方法的建立  27-47
  4.1 实验材料  27
    4.1.1 试剂  27
    4.1.2 仪器  27
  4.2 实验方法  27-30
    4.2.1 QconCAT质粒的生成  27
    4.2.2 QconCAT质粒的转化  27-28
    4.2.3 QconCAT蛋白的表达和纯化  28-29
    4.2.4 QconCAT肽段的标记效率  29
    4.2.5 QconCAT蛋白的精确定量  29-30
    4.2.6 方法的精密度和准确度  30
    4.2.7 标准曲线的制备  30
    4.2.8 混合人肝微粒体中的肝药酶丰度检测  30
  4.3 实验结果  30-45
    4.3.1 QconCAT蛋白的组成及纯化  30-33
    4.3.2 QconCAT肽段离子对的优化  33-35
    4.3.3 重标QconCAT肽段的标记效率  35-37
    4.3.4 轻标和重标QconCAT蛋白的定量  37-38
    4.3.5 方法的精密度和准确度  38-39
    4.3.6 QconCAT肽段的标准曲线  39-43
    4.3.7 混合人肝微粒体中目的蛋白的定量  43-45
  4.4 讨论  45-47
5 结论  47-48
参考文献  48-52
附录  52-63
  参考文献  59-63
攻读硕士学位期间发表的学术论文  63-64
致谢  64

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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