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卡拉胶诱导巨噬细胞免疫响应机制

作 者: 毛海花
导 师: 陈海敏
学 校: 宁波大学
专 业: 海洋生物学
关键词: 卡拉胶 巨噬细胞 TNF-α TLR4 NF-B AP-1
分类号: R285
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
下 载: 3次
引 用: 0次
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内容摘要


卡拉胶(Carrageenan)是从红藻细胞壁中提取的高分子亲水性硫酸酯多糖,基于其良好的增稠、乳化、稳定等特性,被广泛应用于食品、日用化工和医药行业。同时,卡拉胶的安全性问题备受争议,无论是官方机构给出报告认为卡拉胶对人体的健康影响很小,还是研究者质疑卡拉胶具有致癌风险,但目前存在一个共识,即降解的卡拉胶(通常指分子质量10~40kDa的卡拉胶)能够引起炎症。而巨噬细胞是重要的免疫细胞,与机体的炎症反应有密切的联系,目前尚无研究从巨噬细胞角度针对卡拉胶及其降解物进行对比分析。本研究以3种常见的食品级卡拉胶(κ-,ι-,λ-CGN),以及分子量范围10~40kDa的卡拉胶降解产物(κ-,ι-,λ-10-40k)和分子量小于5kDa的卡拉胶降解产物(κ,ι,λ<5k)为对象,以THP-1源性巨噬细胞和RAW264.7细胞为载体,判断易引起巨噬细胞免疫响应的卡拉胶样品,研究卡拉胶引起的免疫响应机制。此外,本文观察了卡拉胶对强致炎剂——脂多糖(LPS)引起的炎性因子表达的影响,并初步判断了其影响机制。不同的卡拉胶样品对巨噬细胞TNF-α的分泌具有不同程度的促进作用,其中,分子质量10~40kDa的降解λ-卡拉胶(λ-10-40k)最易引起巨噬细胞的免疫响应,10μg/mL λ-10-40k对THP-1巨噬细胞和RAW264.7细胞TNF-α的增量分别为空白对照的2.2倍(P<0.01)和5.1倍(P<0.001)。尽管λ-10-40k诱导TNF-α的分泌量并不高,但是λ-10-40k能够协同增强脂多糖的刺激作用,10μg/mL λ-10-40k预处理后,THP-1巨噬细胞和RAW264.7细胞TNF-α的分泌量分别为LPS单独处理组的1.5倍和2.2倍(P<0.05),而分别达到λ-10-40k单独处理组的18倍和30倍。鉴于RAW264.7细胞对λ-10-40k刺激比THP-1源性巨噬细胞更敏感,对LPS的协同增强作用也更明显,进一步分析λ-10-40k诱导的免疫响应机制以及对LPS的协同增强机制,结果发现,λ-10-40k的免疫响应作用与激活TLR4-Bcl10-NF-κB和ERK/MAPK通路有关。而且,λ-10-40k通过提高巨噬细胞的TLR4受体量,以及增强ERK/JNK-AP-1途径的激活,协同增加LPS的炎症效应。本研究表明降解的卡拉胶极可能通过协同增强LPS的刺激作用,从而放大其导致的炎症反应。

全文目录


论文摘要  4-5
Abstract  5-9
引言  9-10
第一章 绪论  10-22
  1 卡拉胶的研究进展  10-15
    1.1 卡拉胶概述  10-12
      1.1.1 卡拉胶的化学结构与分类  10-11
      1.1.2 卡拉胶的应用  11-12
    1.2 卡拉胶的安全性研究  12-15
      1.2.1 卡拉胶的免疫调节作用  12
      1.2.2 卡拉胶的降解  12-13
      1.2.3 卡拉胶的安全性争论  13
      1.2.4 卡拉胶的致炎机制  13-15
  2 Toll 样受体及其信号转导  15-21
    2.1 Toll 样受体  15-17
      2.1.1 TLRs 的结构特异性  15-16
      2.1.2 TLRs 的配体特异性  16-17
    2.2 TLRs 信号转导  17-21
      2.2.1 NF-κB 家族  17-18
      2.2.2 AP-1 家族  18
      2.2.3 TLRs 信号途径  18-20
      2.2.4 TLRs 途径与免疫反应  20-21
  3 展望  21-22
第二章 卡拉胶诱导巨噬细胞免疫响应作用的研究  22-32
  1 实验材料  22-23
    1.1 材料与试剂  22
    1.2 实验细胞  22-23
  2 实验方法  23-24
    2.1 降解卡拉胶的制备  23
    2.2 MTT 法检测细胞存活率  23
    2.3 ELISA 检测 TNF-α的表达  23-24
    2.4 CBA 检测卡拉胶诱导细胞表达部分细胞因子的水平  24
    2.5 数据分析  24
  3 结果  24-30
    3.1 卡拉胶对巨噬细胞存活率的影响  24-26
    3.2 卡拉胶对巨噬细胞分泌 TNF-α的影响  26-28
    3.3 卡拉胶增强 LPS 诱导的 TNF-α表达量  28-29
    3.4 卡拉胶对 THP-1 细胞表达部分细胞因子的影响  29-30
  4 讨论  30-32
第三章 卡拉胶诱导巨噬细胞免疫响应机制的研究  32-51
  1 实验材料  33
    1.1 材料与试剂  33
    1.2 实验细胞  33
  2 实验方法  33-38
    2.1 qRT-PCR 分析 TNF-α mRNA 水平  33-34
    2.2 FACS 检测 RAW264.7 细胞表面 TLR4 表达  34
    2.3 TLR4 抑制剂封阻实验  34
    2.4 Western Blot 检测信号分子变化  34-35
    2.5 EMSA 检测转录因子 DNA 结合活性  35-36
    2.6 报告基因检测转录因子转录活性  36-37
    2.7 基因芯片实验  37
    2.8 数据分析  37-38
  3 结果  38-47
    3.1 卡拉胶诱导 RAW264.7 细胞增强 TNF-α mRNA 表达水平  38
    3.2 卡拉胶诱导 RAW264.7 细胞增强 TLR4 表达  38-40
    3.3 抑制剂封阻 TLR4 对 RAW264.7 细胞表达 TNF-α的影响  40
    3.4 卡拉胶激活 RAW264.7 细胞 TLR4-NF-κB 和 MAPK 信号途径  40-42
    3.5 卡拉胶增强巨噬细胞转录因子 DNA 结合活性  42-43
    3.6 卡拉胶增强巨噬细胞转录因子转录活性  43-44
    3.7 基因芯片结果  44-47
  4 讨论  47-51
第四章 结论  51-52
参考文献  52-59
在学研究成果  59-60
致谢  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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