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卡拉胶诱导巨噬细胞免疫响应机制
作 者: 毛海花
导 师: 陈海敏
学 校: 宁波大学
专 业: 海洋生物学
关键词: 卡拉胶 巨噬细胞 TNF-α TLR4 NF-B AP-1
分类号: R285
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
下 载: 3次
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内容摘要
卡拉胶(Carrageenan)是从红藻细胞壁中提取的高分子亲水性硫酸酯多糖,基于其良好的增稠、乳化、稳定等特性,被广泛应用于食品、日用化工和医药行业。同时,卡拉胶的安全性问题备受争议,无论是官方机构给出报告认为卡拉胶对人体的健康影响很小,还是研究者质疑卡拉胶具有致癌风险,但目前存在一个共识,即降解的卡拉胶(通常指分子质量10~40kDa的卡拉胶)能够引起炎症。而巨噬细胞是重要的免疫细胞,与机体的炎症反应有密切的联系,目前尚无研究从巨噬细胞角度针对卡拉胶及其降解物进行对比分析。本研究以3种常见的食品级卡拉胶(κ-,ι-,λ-CGN),以及分子量范围10~40kDa的卡拉胶降解产物(κ-,ι-,λ-10-40k)和分子量小于5kDa的卡拉胶降解产物(κ,ι,λ<5k)为对象,以THP-1源性巨噬细胞和RAW264.7细胞为载体,判断易引起巨噬细胞免疫响应的卡拉胶样品,研究卡拉胶引起的免疫响应机制。此外,本文观察了卡拉胶对强致炎剂——脂多糖(LPS)引起的炎性因子表达的影响,并初步判断了其影响机制。不同的卡拉胶样品对巨噬细胞TNF-α的分泌具有不同程度的促进作用,其中,分子质量10~40kDa的降解λ-卡拉胶(λ-10-40k)最易引起巨噬细胞的免疫响应,10μg/mL λ-10-40k对THP-1巨噬细胞和RAW264.7细胞TNF-α的增量分别为空白对照的2.2倍(P<0.01)和5.1倍(P<0.001)。尽管λ-10-40k诱导TNF-α的分泌量并不高,但是λ-10-40k能够协同增强脂多糖的刺激作用,10μg/mL λ-10-40k预处理后,THP-1巨噬细胞和RAW264.7细胞TNF-α的分泌量分别为LPS单独处理组的1.5倍和2.2倍(P<0.05),而分别达到λ-10-40k单独处理组的18倍和30倍。鉴于RAW264.7细胞对λ-10-40k刺激比THP-1源性巨噬细胞更敏感,对LPS的协同增强作用也更明显,进一步分析λ-10-40k诱导的免疫响应机制以及对LPS的协同增强机制,结果发现,λ-10-40k的免疫响应作用与激活TLR4-Bcl10-NF-κB和ERK/MAPK通路有关。而且,λ-10-40k通过提高巨噬细胞的TLR4受体量,以及增强ERK/JNK-AP-1途径的激活,协同增加LPS的炎症效应。本研究表明降解的卡拉胶极可能通过协同增强LPS的刺激作用,从而放大其导致的炎症反应。
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全文目录
论文摘要 4-5 Abstract 5-9 引言 9-10 第一章 绪论 10-22 1 卡拉胶的研究进展 10-15 1.1 卡拉胶概述 10-12 1.1.1 卡拉胶的化学结构与分类 10-11 1.1.2 卡拉胶的应用 11-12 1.2 卡拉胶的安全性研究 12-15 1.2.1 卡拉胶的免疫调节作用 12 1.2.2 卡拉胶的降解 12-13 1.2.3 卡拉胶的安全性争论 13 1.2.4 卡拉胶的致炎机制 13-15 2 Toll 样受体及其信号转导 15-21 2.1 Toll 样受体 15-17 2.1.1 TLRs 的结构特异性 15-16 2.1.2 TLRs 的配体特异性 16-17 2.2 TLRs 信号转导 17-21 2.2.1 NF-κB 家族 17-18 2.2.2 AP-1 家族 18 2.2.3 TLRs 信号途径 18-20 2.2.4 TLRs 途径与免疫反应 20-21 3 展望 21-22 第二章 卡拉胶诱导巨噬细胞免疫响应作用的研究 22-32 1 实验材料 22-23 1.1 材料与试剂 22 1.2 实验细胞 22-23 2 实验方法 23-24 2.1 降解卡拉胶的制备 23 2.2 MTT 法检测细胞存活率 23 2.3 ELISA 检测 TNF-α的表达 23-24 2.4 CBA 检测卡拉胶诱导细胞表达部分细胞因子的水平 24 2.5 数据分析 24 3 结果 24-30 3.1 卡拉胶对巨噬细胞存活率的影响 24-26 3.2 卡拉胶对巨噬细胞分泌 TNF-α的影响 26-28 3.3 卡拉胶增强 LPS 诱导的 TNF-α表达量 28-29 3.4 卡拉胶对 THP-1 细胞表达部分细胞因子的影响 29-30 4 讨论 30-32 第三章 卡拉胶诱导巨噬细胞免疫响应机制的研究 32-51 1 实验材料 33 1.1 材料与试剂 33 1.2 实验细胞 33 2 实验方法 33-38 2.1 qRT-PCR 分析 TNF-α mRNA 水平 33-34 2.2 FACS 检测 RAW264.7 细胞表面 TLR4 表达 34 2.3 TLR4 抑制剂封阻实验 34 2.4 Western Blot 检测信号分子变化 34-35 2.5 EMSA 检测转录因子 DNA 结合活性 35-36 2.6 报告基因检测转录因子转录活性 36-37 2.7 基因芯片实验 37 2.8 数据分析 37-38 3 结果 38-47 3.1 卡拉胶诱导 RAW264.7 细胞增强 TNF-α mRNA 表达水平 38 3.2 卡拉胶诱导 RAW264.7 细胞增强 TLR4 表达 38-40 3.3 抑制剂封阻 TLR4 对 RAW264.7 细胞表达 TNF-α的影响 40 3.4 卡拉胶激活 RAW264.7 细胞 TLR4-NF-κB 和 MAPK 信号途径 40-42 3.5 卡拉胶增强巨噬细胞转录因子 DNA 结合活性 42-43 3.6 卡拉胶增强巨噬细胞转录因子转录活性 43-44 3.7 基因芯片结果 44-47 4 讨论 47-51 第四章 结论 51-52 参考文献 52-59 在学研究成果 59-60 致谢 60
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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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