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灵芝有效降糖组分的筛选及降血糖机理研究

作 者: 滕宝松
导 师: 周平
学 校: 复旦大学
专 业: 高分子化学与物理
关键词: 灵芝 抑制剂 糖尿病 蛋白酪氨酸磷酸酶1B
分类号: R284
类 型: 博士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


[目的]传统中医即以灵芝为重要配伍组份用于内分泌、代谢紊乱相关疾病的治疗。本文以蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)为靶点从灵芝子实体中筛选具有有效降血糖效果的PTP1B抑制剂,并对该抑制剂进行理化性质及降血糖机理的研究。[方法]利用醇提、水提和碱提等手段结合醇沉、凝胶柱层析等技术从灵芝子实体中筛选有效降血糖组分;利用高效液相色谱,红外光谱,核磁共振光谱对提取物进行纯度和组成表征;利用分析单糖组成、氨基酸组成、多糖含量、蛋白含量等,建立这些参数与对PTP1B抑制能力的相关性,并研究对PTP1B抑制的动力学;利用链脲霉素(STZ)诱导2型糖尿病小鼠及大鼠,db/db基因型2型糖尿病小鼠对有效降糖提取物进行药效学研究,并与现用临床一线西药二甲双胍及罗格列酮相对照;同时进行了有效提取物的初步急性安全性试验;利用western blotting技术,免疫沉淀技术分析STZ致糖尿病大鼠及基因糖尿病小鼠给药前后肝和骨骼肌组织中PTP1B表达水平和活性的变化及胰岛素受体p亚基(IRβ)磷酸化水平的变化,从而分析有效降糖提取物在体内的降血糖机理;另外,用酶标仪、荧光光谱等研究提取物对a-葡萄糖苷酶、a-淀粉酶、自由基等抑制能力和动力学;此外,用试剂盒分析与糖尿病有关的代谢性疾病的体内血液生化指标。[结果]从灵芝中筛选出7种对PTP1B有抑制效果的组分,其中抑制最有效的组分IC50=5.12±0.05μm/mL,将该组分命名为FYGL;对FYGL组成分析表明,FYGL为分子量2.6×105的蛋白多糖,其中蛋白与多糖含量比为17:77。多糖部分主要由葡聚糖组成,蛋白部分含有19种常见氨基酸;对PTP1B抑制动力学分析表明,FYGL对PTP1B的抑制呈竞争性抑制,即与PTP1B的底物竞争相同的活性位点。动物药效学试验证明,FYGL能显著降低STZ致2型糖尿病模型小鼠及大鼠的血糖,并呈剂量和时间依赖性,且与二甲双胍及罗格列酮相当;同样,db/db基因型糖尿病小鼠药效学实验证明,FYGL亦显著降低小鼠血糖,且与临床一线西药相当;初步急性安全性试验表明,小鼠半致死量LD50=6g/kg,安全性很高;药理学试验证明,对于STZ致糖尿病大鼠,FYGL能降低骨骼肌PTP1B的表达水平和活性,进而调控IRp亚基的磷酸化水平;对于db/db基因型糖尿病小鼠,FYGL能显著降低肝脏和骨骼肌PTP1B的表达水平,降低骨骼肌PTP1B的活性,增加肝脏和骨骼肌IRp亚基的磷酸化水平。此外,STZ致糖尿病大鼠试验表明,FYGL不仅能显著降低血糖,而且能增加血清胰岛素浓度,降低胰岛素抵抗指数,增加胰岛素分泌指数,提示FYGL可能有修复胰岛细胞的功能;FYGL亦能降低db/db小鼠胰岛素抵抗指数,但不能促进胰岛素的分泌。另外,FYGL对a-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、自由基等亦有抑制能力,对α-葡萄糖苷酶亦呈竞争性抑制机理,提示FYGL可能具有多靶点降糖作用功能。同时,FYGL能有效改善STZ致2型糖尿病大鼠及db/db小鼠中与代谢紊乱综合症相关的血脂生化指标,如自由脂肪酸(FFA)、甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。[结论]FYGL有显著降低血糖能力,与临床一线西药二甲双胍及罗格列酮相当,且安全性高,其降血糖机理是通过降低体内肝脏和骨骼肌PTP1B表达水平,降低骨骼肌PTP1B活性,进而调控胰岛素受体p亚基的磷酸化水平,同时降低胰岛素抵抗指数。另外,FYGL可能具有多靶点降糖作用功能,同时改善与糖尿病代谢紊乱综合症相关的血脂生化指标。FYGL是一种新型胰岛素增敏剂,有望成为糖尿病治疗的候选新药。

全文目录


目录  3-7
缩略词表  7-8
中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
第一章 前言  12-26
  第一节 灵芝的研究概述  12-19
    1.1 灵芝的化学成分研究  12-15
    1.2 灵芝的药理作用  15-19
  第二节 蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)  19-23
    2.1 PTP家族概述  19-20
    2.2 PTP1B简介  20-22
    2.3 PTP1B与胰岛素信号传导  22-23
  第三节 课题的立题依据与主要研究内容  23-26
第二章 灵芝子实体有效降糖组分的筛选及其理化性质研究  26-50
  第一节 材料和方法  26-34
    1.1 材料  26-27
    1.2 实验方法  27-34
      1.2.1 灵芝中PTP1B抑制剂的筛选及提取物的纯化  27-28
      1.2.2 提取物对PTP1B的抑制能力分析  28
      1.2.3 提取物纯度检测  28-29
      1.2.4 提取物元素组成分析  29
      1.2.5 提取物单糖组成分析  29-30
      1.2.6 提取物氨基酸组成分析  30
      1.2.7 提取物多糖含量的苯酚-硫酸法分析  30
      1.2.8 提取物蛋白含量的Lowry法分析  30-31
      1.2.9 提取物组成表征  31
      1.2.10 提取物分子量测定  31-33
      1.2.11 提取物抑制PTP1B活性的动力学  33
      1.2.12 统计学分析  33-34
  第二节 结果与分析  34-47
    2.1 提取物的分离纯化及对PTP1B的抑制  34-36
    2.2 FYGL的元素组成  36
    2.3 FYGL的单糖组成  36-37
    2.4 FYGL氨基酸组成  37-38
    2.5 FYGL多糖和蛋白含量  38-39
    2.6 FYGL组成的红外光谱表征  39-40
    2.7 FYGL组成的核磁共振波谱表征  40-42
    2.8 FYGL分子量测定  42-45
    2.9 FYGL抑制PTP1B活性的动力学  45-47
  第三节 讨论  47-50
    3.1 PTP1B抑制剂  47
    3.2 灵芝有效降糖组分的筛选及有效成分的类型  47-48
    3.3 FYGL对PTP1B的抑制动力学  48-50
第三章 灵芝子实体有效降糖组分的体内药效学及毒性检测  50-64
  第一节 材料和方法  50-54
    1.1 材料  50-51
    1.2 试验方法  51-54
      1.2.1 主要溶液的配制  51-52
      1.2.2 糖尿病模型鼠的构建  52-53
      1.2.3 FYGL对血清胰岛素浓度、抵抗指数及分泌指数的影响  53
      1.2.4 急性毒性实验  53
      1.2.5 统计学处理  53-54
  第二节 结果与分析  54-62
    2.1 动物模型一般观察  54-55
    2.2 FYGL对血清葡萄糖水平的影响  55-58
    2.3 FYGL对血清胰岛素浓度、抵抗指数及分泌指数的影响  58-60
    2.4 FYGL急性毒性  60-62
  第三节 讨论  62-64
    3.1 胰岛素抵抗与STZ造模  62-63
    3.2 FYGL对STZ诱导与db/db基因模型鼠试验结果的比较  63-64
第四章 灵芝子实体有效降糖组分的动物药理学检测  64-78
  第一节 材料和方法  64-69
    1.1 材料  64-65
    1.2 试验方法  65-69
      1.2.1 糖尿病模型的构建(同第三章)  65
      1.2.2 肝脏和骨骼肌组织的取材  65
      1.2.3 FYGL对肝脏和骨豁肌组织中PTP1B表达水平的影响  65-66
      1.2.4 FYGL对肝脏和骨骼肌组织中PTP1B活性的影响  66-67
      1.2.5. FYGL对肝脏和骨骼肌组织中胰IRβ亚基磷酸化水平的影响  67-68
      1.2.6 统计学处理  68-69
  第二节 结果与分析  69-76
    2.1 FYGL对肝脏和骨骼肌组织中PTP1B表达水平的影响  69-71
    2.2 FYGL对肝脏和骨骼肌组织中PTP1B活性的影响  71-73
    2.3 FYGL对肝脏和骨骼肌组织中IRβ磷酸化水平的影响  73-76
  第三节 讨论  76-78
    3.1 FYGL对PTP1B表达水平和活性的影响  76
    3.2 FYGL对IRβ亚基磷酸化水平的影响  76-78
第五章 灵芝子实体有效降糖组分其它生物活性的检测  78-96
  第一节 材料和方法  78-84
    1.1 材料  78-79
    1.2 实验方法  79-84
      1.2.1 酶标仪检测FYGL对α-葡萄糖苷酶的抑制  79-80
      1.2.2 FYGL抑制α-葡萄糖苷酶活性的动力学  80
      1.2.3 荧光光谱检测FYGL对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制  80
      1.2.4 FYGL对小肠葡萄糖苷酶活性的影响  80-81
      1.2.5 UV分析FYGL对DPPH自由基活性的抑制  81-82
      1.2.6. 邻苯三酚自氧化法检测FYGL对氧负离子自由基抑制能力  82-83
      1.2.7 统计学处理  83-84
  第二节 结果与分析  84-92
    2.1 酶标仪检测FYGL对α-葡萄糖苷酶活性的抑制  84
    2.2 FYGL对α-葡萄糖苷酶抑制动力学的分析  84-86
    2.3 内源荧光法检测FYGL对α-葡萄糖苷酶活性的抑制  86-87
    2.4 内源荧光光谱检测FYGL对α-淀粉酶活性的抑制  87-88
    2.5 FYGL对小肠葡萄糖昔酶活性的影响  88-90
    2.6 FYGL对DPPH自由基活性的抑制  90-91
    2.7 FYGL对氧负离子自由基活性的抑制  91-92
  第三节 讨论  92-96
    3.1 α-糖苷酶抑制剂  92-93
    3.2 FYGL体内对小肠α-葡萄糖苷酶活性的影响  93-94
    3.3 FYGL抗氧化活性  94-96
第六章 灵芝子实体有效降糖组分对代谢相关生化指标的影响  96-104
  第一节 材料和方法  96-99
    1.1 材料  96-97
    1.2 试验方法  97-99
      1.2.1 FYGL对血清自由脂肪酸的影响  97
      1.2.2 FYGL对血清甘油三酯的影响  97
      1.2.3 FYGL对血清总胆固醇的影响  97
      1.2.4 FYGL对血清低密度脂蛋白胆固醇的影响  97-98
      1.2.5 FYGL对血清高密度脂蛋白胆固醇影响  98
      1.2.6 统计学处理  98-99
  第二节 结果与分析  99-102
    2.1 FYGL对STZ致糖尿病大鼠血脂的影响  99-100
    2.2 FYGL对db/db2型糖尿病小鼠血脂的影响  100-102
  第三节 讨论  102-104
第七章 结论  104-105
第八章 待开展工作  105-108
  8.1 FYGL结构解析及与PTP1B相互作用的方式  105
  8.2 FYGL对小肠黏膜转运葡萄糖及餐后2h血糖的影响  105-106
  8.3 FYGL对糖化血红蛋白的影响  106
  8.4 FYGL的药代动力学  106-108
参考文献  108-120
攻读博士期间发表和待发表的论文及专利  120-121
致谢  121-122
个人简历  122-123

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学
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