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红豆杉单组份多糖的分离,结构特性分析和对心肌细胞作用的研究
作 者: 王如涛
导 师: 吴绵斌
学 校: 浙江大学
专 业: 生物化工
关键词: 红豆杉多糖 色谱分离纯化 心肌细胞 MTS 流式细胞术
分类号: R284.2
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
由于植物多糖的来源广泛且无毒副作用,植物多糖的相关生物学研究逐渐受到关注,近年来,越来越多的植物多糖被分离、鉴定出来,而且研究发现这些植物多糖具有免疫调节、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血等生物学活性。本论文以珍贵的药用植物红豆杉的枝叶为样品,对其DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱分离工艺进行了优化,确定了该工艺最终条件Tris-HCl缓冲液pH约为8.5,盐浓度为0.01M,梯度洗脱的盐浓度梯度选取0.1M、0.3M、0.5M(用平衡缓冲液配制),梯度洗脱流速为11.5mL/min。其次,对离子交换色谱分离得到的红豆杉多糖组份峰进行G-]00与G-10凝胶过滤分离纯化,最终得到重均分子量(MW)分别为135276Da、8862Da、73527Da的红豆杉多糖CPTC-1a、CPTC-1b与CPTC-2;而且为高纯度。这三个红豆杉多糖的红外光谱分析表明它们都在893cm-1处有吡喃环的β-型C-H变角振动的特征峰,即β-型糖苷键特征峰;而且单组份多糖CPTC-1b与单组份多糖CPTC-2在838cm-1处有吡喃环的α-型C-H变角振动的特征吸收峰,即α-型糖苷键特征峰;单组份多糖CPTC-2可能含有D-半乳糖;而单组份多糖CPTC-1a在838cm-1与957cm-1两个光波附近都不含有相应吸收峰。随后,本论文对红豆杉总糖、红豆杉多糖组份CPTC-1a、CPTC-1b、CPTC-2做了关于心肌细胞的MTS测试,结果表明红豆杉总糖在低浓度范围内对正常心肌细胞的增殖影响不大,当浓度大于125μg/mL时,对心肌细胞的增殖具有抑制作用。红豆杉多糖组份CPTC-2在大于8μg/mL的浓度范围内,对心肌细胞的增殖具有抑制作用。红豆杉多糖组份CPTC-1a和CPTC-1b不仅抑制心肌细胞增殖,而且对增殖的抑制作用具有浓度依赖性,对心肌细胞不具有保护作用。最后,利用流式细胞术分析了红豆杉总糖、红豆杉多糖组份CPTC-1a、 CPTC-1b、CPTC-2对心肌细胞细胞周期的影响,表明这几种多糖都不会诱导凋亡,而且单组份多糖CPTC-2在低浓度条件下(<8μg/mL)对心肌细胞增殖无抑制作用;在100μg/mL的浓度时,红豆杉总糖可以使心肌细胞细胞周期变慢,对其具有保护作用,红豆杉多糖组份CPTC-1a、CPTC-1b、CPTC-2对心肌细胞可能具有协同机制。
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全文目录
致谢 4-5 摘要 5-7 ABSTRACT 7-9 目录 9-12 第一章 文献综述 12-30 1.1 研究背景及意义 12-13 1.2 植物多糖分离提取工艺的研究进展 13-21 1.2.1 植物枝叶的预处理 13 1.2.2 植物多糖的粗提 13-15 1.2.3 植物多糖的脱色 15-16 1.2.4 植物多糖的分离纯化工艺 16-20 1.2.5 植物多糖分离提取工艺流程 20-21 1.3 植物多糖的性质与结构鉴定研究进展 21-27 1.3.1 植物多糖含量的测定 21-22 1.3.2 植物多糖纯度与分子量的测定 22-24 1.3.3 植物多糖结构的测定 24-27 1.4 植物多糖的药效研究进展 27-28 1.5 红豆杉研究现状 28-29 1.6 研究方向与研究内容 29-30 1.6.1 研究方向 29 1.6.2 研究内容 29-30 第二章 实验材料、仪器和方法 30-36 2.1 实验材料 30 2.1.1 实验样品 30 2.1.2 实验细胞种类 30 2.1.3 树脂 30 2.2 实验药品与试剂 30-32 2.2.1 实验药品与试剂 30-31 2.2.2 溶液配制 31-32 2.3 主要仪器设备 32-33 2.4 分析检测方法 33-36 2.4.1 多糖含量的测定 33-36 2.4.1.1 硫酸苯酚法测定总糖含量 33-34 2.4.1.2 3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖含量 34-36 第三章 红豆杉单组份多糖的分离提取 36-48 3.1 引言 36 3.2 实验方法 36-39 3.2.1 红豆杉粗多糖的制备 36-37 3.2.2 DEAE sepharose fast flow离子交换色谱分离红豆杉粗多糖 37-38 3.2.2.1 DEAE sepharose fast flow色谱分离的吸附条件优化 37-38 3.2.2.2 DEAE sepharose fast flow色谱分离的洗脱条件优化 38 3.2.3 不同多糖峰组份的凝胶过滤色谱分离 38-39 3.2.3.1 G-100凝胶过滤色谱分离第一组份峰红豆杉粗多糖 38-39 3.2.3.2 不同多糖组份的凝胶过滤色谱纯化 39 3.3 结果与讨论 39-47 3.3.1 红豆杉粗多糖的制备 39-40 3.3.2 DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱分离 40-44 3.3.2.1 缓冲液pH对红豆杉粗多糖的吸附的影响 40-42 3.3.2.2 缓冲液离子强度对红豆杉粗多糖的吸附的影响 42 3.3.2.3 不同浓度的NaCl溶液对红豆杉粗多糖的梯度洗脱 42-43 3.3.2.4 流速对红豆杉粗多糖的洗脱的影响 43-44 3.3.3 凝胶过滤色谱对各组份峰多糖的分离纯化 44-47 3.3.3.1 G-100对红豆杉多糖CPTC-1组份峰的分离 44-46 3.3.3.2 G-10对红豆杉多糖CPTC-1b的纯化 46 3.3.3.3 G-10对红豆杉粗多糖CPTC-2的纯化 46-47 3.4 小结 47-48 第四章 红豆杉单组份多糖的结构特性分析及对心肌细胞的作用 48-66 4.1 引言 48 4.2 实验方法 48-50 4.2.1 分子量的测定 48-49 4.2.2 单组份多糖组成的鉴定 49 4.2.3 单组份多糖的红外光谱测定 49 4.2.4 不同多糖对大鼠心肌细胞H9c2作用的初步研究 49-50 4.2.4.1 MTS法研究多糖及其浓度对大鼠心肌细胞H9c2增殖的影响 49-50 4.2.4.2 流式细胞术分析红豆杉多糖对心肌细胞H9c2细胞周期的影响 50 4.3 数据统计学分析 50 4.4 结果与讨论 50-64 4.4.1 红豆杉单组份多糖分子量测定 50-53 4.4.2 单组份多糖组成的鉴定 53 4.4.3 红豆杉单组份多糖的红外光谱分析 53-57 4.4.4 MTS法测定红豆杉多糖对心肌细胞的增殖作用 57-60 4.4.5 流式细胞术检测红豆杉多糖对心肌细胞H9c2细胞周期的影响 60-64 4.5 结论 64-66 第五章 结论与建议 66-68 5.1 结论 66-67 5.2 建议 67-68 参考文献 68-76 作者简介 76
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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学 > 有效成分的分离与提取
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