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鹿角盘提取物的体外抗骨质疏松作用

作　者: 吴菲菲
导　师: 徐永平
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 鹿角盘提取物 骨质疏松症 成骨细胞 破骨细胞 微切变-助剂互作技术
分类号: R259
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构退行性改变,骨的脆性增加,易于发生骨折为特征的全身代谢性骨骼疾病,多发于绝经后妇女及老年人。骨质疏松性骨折发病率高,严重威胁着人们的生命健康,并给社会和国家带来了沉重的经济负担。目前,用于治疗骨质疏松症的西药,如鲑鱼降钙素、双膦酸盐类和重组人甲状旁腺素等,具有明显的副作用且价格昂贵。因此,研究开发安全、高效、经济的抗骨质疏松症药物已成为目前的研究热点。据《神农本草经》记载,鹿角盘具有温补肝肾、强筋健骨、活血消肿等作用。经我们课题组前期的体内实验研究发现,鹿角盘微切助粉对去卵巢大鼠绝经后骨质疏松症模型有明显且良好的治疗效果。但是,关于鹿角盘防治骨质疏松症的作用机制至今仍未有报道。因此,本论文旨在系统地研究鹿角盘提取物对体外培养的成骨细胞骨形成功能和破骨细胞骨吸收活性的影响,并进一步探讨其防治骨质疏松症的作用机制。具体研究内容和结果如下：(1)采用微切变-助剂互作技术加工制备鹿角盘微切助粉。然后经粒径分析及扫描电镜观察分析细胞的破碎程度,并检测其中与骨质疏松症相关的活性物质的含量。粒径分析及扫描电镜观察结果显示,经微切变-助剂互作技术处理后,鹿角盘微切助粉在粒径1-30μm范围内的颗粒数占82.73%,且细胞已被充分破碎,细胞内有效成分被暴露出来,呈释放的状态。活性物质含量分析结果显示,鹿角盘微切助粉中含有328.79士34.21pmol/L雌二醇、25.38士4.48nmol/L睾酮、17.56士3.45nmol/L孕酮,0.750±0.033μg/g类胰岛素生长因子-1,16.17±0.52mg/L柠檬酸钙和133.6±13.55mg/L钙,而不含有延胡索酸钙。且这些活性物质的含量均高于其粗粉,说明微切变-助剂互作技术增加了目标活性物质的溶出量,有利于鹿角盘中活性成分的释放,体现了该技术的优越性。(2)以人类成骨样细胞MG-63为研究对象,系统地研究了鹿角盘提取物(水提物和醇提物)对成骨细胞生长、分化和矿化的影响及其防治骨质疏松症的可能作用机制。LDH活性检测和细胞形态观察结果表明,鹿角盘提取物对成骨细胞没有细胞毒性作用。采用结晶紫试验、中性红吸收试验、台盼蓝排斥试验、MTT法和ALP活性检测考察细胞的生长和分化情况。结果表明,鹿角盘提取物不仅刺激了成骨细胞的生长和增殖,而且还促进了成骨细胞的分化。此外,茜素红-S染色和4-羟脯氨酸含量的检测结果显示,鹿角盘提取物是通过促进钙的沉积和增加Ⅰ型胶原蛋白的合成和分泌,促进矿化骨基质的形成,从而发挥促进骨形成的作用。采用ELISA法和RT-PCR分别检测了OPG和RANKL的蛋白含量和mRNA的表达量,结果显示,鹿角盘提取物极显著地增加了成骨细胞中OPG蛋白含量和OPG mRNA的表达量,而降低了RANKL蛋白含量和RANKL mRNA的表达量,提高了成骨细胞中OPG/RANKL的比值,间接地抑制破骨细胞的分化和成熟,从而起防治骨质疏松症的作用。(3)以RAW264.7细胞作为一种破骨前体细胞模型,诱导其分化成破骨细胞,并研究鹿角盘提取物对破骨细胞的形成和骨吸收活性的影响。TRAP染色和破骨细胞计数结果显示,用50ng/mL RANKL成功地诱导RAW264.7细胞分化成为成熟的破骨细胞。而且鹿角盘提取物可剂量依赖性地减少破骨细胞的数量,降低破骨细胞中TRAP的活性,从而抑制了RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成成熟的破骨细胞。LDH活性检验、PI染色和DNA碎片定量分析结果一致表明,鹿角盘提取物是通过诱导成熟的破骨细胞发生凋亡而抑制其活性。而且,RT-PCR检测结果表明鹿角盘提取物是通过下调破骨细胞表型基因TRAP mRNA和MMP-9mRNA的表达,来抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性,从而起防治骨质疏松症的作用。(4)采用p38特异性抑制剂SB203580干预处理MG-63成骨细胞,进一步验证鹿角盘提取物的抗骨质疏松作用机制。用p38特异性抑制剂SB203580干预处理成骨细胞,然后采用MTT法、ALP法、茜素红-S染色和4-羟脯氨酸含量的检测分别评价SB203580对成骨细胞的增殖、分化和矿化的影响。结果表明,SB203580可以有效地阻断鹿角盘提取物对成骨细胞增殖、分化和矿化骨基质形成的促进作用。而且,用ELISA法和RT-PCR检测OPG和RANKL蛋白含量和基因的表达,结果显示鹿角盘提取物上调了OPG蛋白和mRNA的表达,下调了RANKL蛋白和mRNA的表达,且通过调控成骨细胞中OPG和RANKL的表达,间接地抑制破骨细胞的分化和成熟。而SB203580能有效地阻断鹿角盘提取物对破骨细胞的抑制作用,提示鹿角盘提取物是通过调控p38MAPK信号通路,双向影响成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡,从而起抗骨质疏松的作用。综上所述,本研究证实了鹿角盘提取物是通过调控p38MAPK信号通路来促进成骨细胞的骨形成和抑制破骨细胞的骨吸收,从而起抗骨质疏松的作用,为鹿角盘用于治疗骨质疏松症提供了理论依据。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-9
缩略词表  9-18
引言  18-20
1 文献综述  20-53
  1.1 骨质疏松症的研究进展  20-42
    1.1.1 骨质疏松症的定义  20
    1.1.2 骨质疏松症的类型  20-21
    1.1.3 骨质疏松症的危害  21-22
    1.1.4 骨质疏松症的发病机理  22-36
      1.1.4.1 成骨细胞生理学  25-29
      1.1.4.2 破骨细胞生理学  29-33
      1.1.4.3 OPG-RANKL-RANK系统  33-36
    1.1.5 骨质疏松症的预防与治疗  36-42
      1.1.5.1 骨质疏松症的预防  37-38
      1.1.5.2 西药治疗骨质疏松症  38-41
      1.1.5.3 中药治疗骨质疏松症  41-42
  1.2 鹿角盘的研究进展  42-51
    1.2.1 鹿角盘的活性成分  44-46
      1.2.1.1 无机元素  44
      1.2.1.2 氨基酸、多肽和蛋白质  44-45
      1.2.1.3 脂质类和多糖类  45-46
    1.2.2 鹿角盘的现代药理学功能  46-50
      1.2.2.1 抗乳腺增生作用  46
      1.2.2.2 免疫增强作用  46-47
      1.2.2.3 抗癌作用  47
      1.2.2.4 抗疲劳作用  47-48
      1.2.2.5 抗菌作用  48
      1.2.2.6 抗病毒作用  48
      1.2.2.7 抗炎镇痛作用  48-49
      1.2.2.8 抗氧化作用  49
      1.2.2.9 抗应激作用  49
      1.2.2.10 抗骨质疏松作用  49-50
      1.2.2.11 造血作用  50
      1.2.2.12 降糖作用  50
      1.2.2.13 鹿角盘的安全性  50
    1.2.3 鹿角盘的临床应用  50-51
      1.2.3.1 治疗乳腺增生  50-51
      1.2.3.2 治疗乳腺炎和乳头皲裂  51
      1.2.3.3 治疗癌症  51
  1.3 本论文的选题依据和研究内容  51-53
    1.3.1 选题依据  51-52
    1.3.2 研究内容  52-53
2 微切变-助剂互作技术制备鹿角盘微切助粉及其活性物质的检测  53-65
  2.1 实验材料与设备  53-54
    2.1.1 实验试剂  53
    2.1.2 实验仪器  53-54
  2.2 实验方法  54-57
    2.2.1 鹿角盘微切助粉的制备  54-55
    2.2.2 颗粒粒径检测  55
    2.2.3 扫描电镜观察  55
    2.2.4 性激素含量的测定  55
    2.2.5 类胰岛素样生长因子-1含量的测定  55
    2.2.6 有机酸钙含量的测定  55-57
    2.2.7 钙含量的测定  57
    2.2.8 统计学分析  57
  2.3 实验结果  57-62
    2.3.1 鹿角盘粉末的颗粒粒径分布  57-59
    2.3.2 鹿角盘粉末的颗粒形态分析  59-60
    2.3.3 鹿角盘粉末中性激素含量的分析  60
    2.3.4 鹿角盘粉栋中类胰岛素样生长因子-1含量的分析  60-61
    2.3.5 鹿角盘粉末中有机酸钙和钙含量的分析  61-62
  2.4 讨论  62-64
  2.5 小结  64-65
3 鹿角盘提取物对成骨细胞增殖、分化和矿化作用的影响  65-96
  3.1 实验材料与设备  65-67
    3.1.1 实验试剂  65-66
    3.1.2 实验仪器  66-67
  3.2 实验方法  67-74
    3.2.1 鹿角盘提取物的制备  67-68
      3.2.1.1 鹿角盘水提物的制备  67
      3.2.1.2 鹿角盘醇提物的制备  67-68
    3.2.2 成骨细胞培养  68
    3.2.3 细胞活性检测  68-69
      3.2.3.1 结晶紫试验  68
      3.2.3.2 中性红吸收试验  68-69
      3.2.3.3 台盼蓝排斥试验  69
    3.2.4 MTT法检测细胞增殖  69-70
    3.2.5 细胞形态观察  70
      3.2.5.1 染色观察  70
      3.2.5.2 倒置相差显微镜观察  70
    3.2.6 乳酸脱氢酶活性测定  70-71
    3.2.7 碱性磷酸酶活性测定  71
    3.2.8 矿化骨结节形成的检测  71
    3.2.9 胶原蛋白含量测定  71-72
    3.2.10 ELISA法检测OPG和RANKL含量  72
    3.2.11 RNA提取和RT-PCR反应  72-73
    3.2.12 统计学分析  73-74
  3.3 实验结果  74-93
    3.3.1 鹿角盘提取物对成骨细胞作用的预试验  74-75
    3.3.2 鹿角盘提取物对成骨细胞活性和增殖的影响  75-79
    3.3.3 鹿角盘提取物对成骨细胞形态的影响  79-81
    3.3.4 鹿角盘提取物对成骨细胞中乳酸脱氢酶活性的影响  81-82
    3.3.5 鹿角盘提取物对成骨细胞中碱性磷酸酶活性的影响  82-84
    3.3.6 鹿角盘提取物对矿化骨基质形成的影响  84-86
    3.3.7 鹿角盘提取物对成骨细胞中胶原蛋白含量的影响  86-87
    3.3.8 鹿角盘提取物对成骨细胞中OPG和RANKL含量的影响  87-90
    3.3.9 鹿角盘提取物对OPG和RANKL mRNA表达量的影响  90-93
  3.4 讨论  93-95
  3.5 小结  95-96
4 鹿角盘提取物对RANKL诱导形成的破骨细胞的影响  96-120
  4.1 实验材料与设备  97-98
    4.1.1 实验试剂  97-98
    4.1.2 实验仪器  98
  4.2 实验方法  98-103
    4.2.1 鹿角盘提取物的制备  98-99
    4.2.2 细胞培养  99
    4.2.3 细胞活性检测  99
    4.2.4 MTT法检测细胞增殖  99-100
    4.2.5 诱导破骨细胞形成的实验  100
    4.2.6 TRAP染色及破骨细胞数量的测定  100
    4.2.7 破骨细胞中TRAP活性的测定  100
    4.2.8 破骨细胞中乳酸脱氢酶活性的测定  100-101
    4.2.9 破骨细胞凋亡分析  101
    4.2.10 RNA提取和RT-PCR反应  101-103
    4.2.11 统计学分析  103
  4.3 实验结果  103-117
    4.3.1 鹿角盘提取物对RAW264.7细胞活性和增殖的影响  103-105
    4.3.2 RANKL诱导RAW264.7细胞分化成破骨细胞的检测  105-106
    4.3.3 鹿角盘提取物对破骨细胞形成的影响  106-108
    4.3.4 鹿角盘提取物对破骨细胞中TRAP活性的影响  108-109
    4.3.5 鹿角盘提取物对破骨细胞中乳酸脱氢酶活性的影响  109-111
    4.3.6 鹿角盘提取物诱导破骨细胞发生凋亡  111-114
    4.3.7 鹿角盘提取物对TRAP和MMP-9 mRNA表达量的影响  114-117
  4.4 讨论  117-119
  4.5 小结  119-120
5 鹿角盘提取物对p38 MAPK信号通路的调控作用  120-137
  5.1 实验材料与设备  121
    5.1.1 实验试剂  121
    5.1.2 实验仪器  121
  5.2 实验方法  121-123
    5.2.1 鹿角盘提取物的制备  121
    5.2.2 成骨细胞培养  121
    5.2.3 实验分组  121-122
    5.2.4 MTT法检测细胞增殖  122
    5.2.5 碱性磷酸酶活性测定  122
    5.2.6 矿化骨结节形成的检测  122
    5.2.7 胶原蛋白含量测定  122
    5.2.8 ELISA法检测OPG和RANKL含量  122
    5.2.9 RNA提取和RT-PCR反应  122
    5.2.10 统计学分析  122-123
  5.3 实验结果  123-134
    5.3.1 鹿角盘提取物对成骨细胞增殖的影响  123-124
    5.3.2 鹿角盘提取物对成骨细胞分化的影响  124-125
    5.3.3 鹿角盘提取物对矿化骨基质形成的影响  125-127
    5.3.4 鹿角盘提取物对胶原蛋白累积的影响  127-129
    5.3.5 鹿角盘提取物对OPG和RANKL蛋白含量的影响  129-132
    5.3.6 鹿角盘提取物对OPG和RANKL mRNA表达量的影响  132-134
  5.4 讨论  134-136
  5.5 小结  136-137
结论与展望  137-140
  结论  137-139
  展望  139-140
创新点摘要  140-141
参考文献  141-161
附录A 溶液的配制  161-164
附录B 人骨保护素(OPG)酶联免疫检测试剂盒使用说明书  164-168
附录C 人骨保护素配体(OPGL)酶联免疫检测试剂盒使用说明书  168-172
攻读博士学位期间发表学术论文情况  172-174
致谢  174-175
作者简介  175-176

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