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P25/CDK5-p53通路在BaP致神经细胞凋亡中的作用研究

作　者: 席华星
导　师: 牛侨
学　校: 山西医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 苯并[a]芘神经毒性 DNA损伤 calpain p25/CDK5 p53
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

[目的]利用大鼠原代培养皮质神经细胞研究p25/CDK5-p53通路在BaP致神经细胞凋亡中作用,探讨BaP致神经细胞凋亡的作用机制。[方法]1.体外原代大鼠皮质神经元培养：采用新生1-3天的SD大鼠,在无菌条件下取出大脑皮质并用0.25%胰酶消化,以1000个／mm2接种神经细胞。在神经细胞培养第五天左右,选取生长良好的同批次细胞,以BaP同时加入S9染毒,染毒浓度分别为10、20、40μmol/L并设空白对照组、溶剂对照(DMSO)组和S9对照组,染毒后继续培养观察,分别于染毒0,6,12,24,48h后处理细胞。2.①显微镜观察神经细胞形态学变化,采用MTT法和流式细胞仪分别检测神经细胞活力和凋亡率；②单细胞琼脂糖凝胶电泳和BPDE-DNA Adduct ELISA试剂盒检测神经细胞DNA损伤情况；③流式细胞仪检测神经细胞活性氧变化情况；④Western-blot法检测神经细胞p25/CDK5-p53通路相关蛋白calpain、p35/25、 CDK5、p53和p-p53Ser15表达；⑤抑制calpain活性和CDK5活性后,检测上述相关指标变化情况。⑥RT-PCR检测calpain、p25、CDK5基因表达情况。[结果]1.BaP染毒48h后,随着染毒剂量的增加,神经细胞活力呈下降趋势,低、中、高剂量组神经细胞活力分别下降了13.9%,19.0%,22.5%。随着BaP染毒剂量的增加以及染毒时间的延长,神经细胞数量减少,胞体收缩,突触变少变短,细胞间连接减少。AO-EB染色结果显示,随着BaP染毒剂量的增加以及染毒时间的延长,神经细胞出现明显的橘黄色凋亡细胞。析因设计方差分析结果显示,随着染毒时间的延长,不同浓度BaP组凋亡率增高；BaP染毒与神经细胞凋亡率之间存在剂量和时间依赖性,且剂量与时间之间存在交互作用(P<0.001)。在BaP染毒48h后,低、中、高剂量组与空白对照组相比神经细胞凋亡率分别增加了0.66,1.90和2.14倍。2.神经细胞olive尾矩随着BaP染毒时间的延长,浓度增加呈现上升趋势；且BaP染毒与神经细胞olive尾矩之间存在剂量和时间依赖性,剂量与时间之间存在交互作用(P<0.001)。在BaP染毒48h后,低、中、高剂量组与空白对照组相比神经细胞olive尾矩分别增加了0.33,0.77和1.68倍。神经细胞BPDE-DNA加合物含量随着BaP染毒时间的延长,不同浓度BaP组BPDE-DNA量增加;BaP染毒与神经细胞BPDE-DNA量之间存在剂量和时间依赖性,且剂量与时间之间存在交互作用(P<0.001)。在BaP染毒48h后,低、中、高剂量组与空白对照组相比神经细胞BPDE-DNA量分别增加了1.02,1.27和1.59倍。3.神经细胞活性氧随着染毒时间的延长、BaP浓度增加活性氧呈现上升趋势；BaP染毒与神经细胞活性氧之间存在剂量和时间依赖性,且剂量与时间之间存在交互作用(P<0.001)。在BaP染毒48h后,低、中、高剂量组与空白对照组相比神经细胞活性氧分别增加了0.75,0.97和1.64倍。4.随着染毒时间的延长,不同浓度BaP组神经细胞α-spectrin、p35、p25、CDK5、 p53、p-p53Ser15蛋白表达量增加；BaP染毒与神经细胞α-spectrin、p35、p25、 CDK5、p53、p-p53Ser15蛋白表达量之间存在剂量和时间依赖性,且剂量与时间之间存在交互作用(P<0.001)。在BaP染毒48h后,低、中、高剂量组与空白对照组相比神经细胞α-spectrin、p35、p25、CDK5、p53、p-p53Ser15蛋白表达量分别增加了1.71,1.95和2.40倍,0.94,1.19和1.69倍；0.91,2.00和3.03倍；1.40,1.78和3.10倍；0.45,0.51和0.73倍；1.25,1.36和1.96倍。5.MDL28170特异性抑制calpain活性后神经细胞凋亡率有所下降；48h后低、中、高剂量组神经细胞凋亡率分别降低了47%,68%和71%。相应的神经细胞α-spectrin、p35、CDK5、p53、p-p53Ser15蛋白表达量下降；BaP作用48h后,低、中、高剂量组神经细胞α-spectrin、p35、CDK5、p53、p-p53Serl5蛋白表达量分别降低了46%,47%和50%；42%,47%和48%；54%,57%和70%；29%,34%和37%；48%,45%和53%。6.Roscovitine特异性拮抗CDK5活性后神经细胞凋亡率呈下降趋势；48h后低、中、高剂量组神经细胞凋亡率分别降低了37%,42%和47%。相应的神经细胞CDK5、p53、p-p53Ser15蛋白表达量下降；BaP作用48h后,低、中、高剂量组神经细胞CDK5、p53、p-p53Ser15蛋白表达量分别降低了37%,42%和60%;38%,30%和37%；53%,50%和58%。7.BaP染毒48h后,随着染毒剂量的增加,神经细胞calpain、p25、CDK5基因表达呈上升趋势,与空白对照组相比,高剂量组神经细胞calpain、p35、CDK5基因表达量分别增加了8.02,2.96和1.94倍。[结论]1.BaP可引起神经细胞DNA损伤和氧化应激,且BaP染毒与神经细胞DNA损伤及氧化应激之间存在剂量效应和时间效应关系；2.BaP可引起神经细胞凋亡,且BaP染毒与神经细胞凋亡之间存在剂量效应和时间效应关系；且从时间序列上可以看出,BaP可能通过DNA损伤及氧化应激致神经细胞凋亡。3.BaP引起神经细胞DNA损伤和氧化应激后,可能通过激活calpain,经p25/CDK5-p53通路致神经细胞凋亡。

全文目录

目录  4-5
英文缩略词表  5-6
摘要  6-9
Abstract  9-12
前言  12-15
材料与方法  15-26
实验结果  26-50
讨论  50-55
总结  55-56
参考文献  56-64
综述  64-74
  参考文献  69-74
致谢  74-75
个人简历  75

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