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吸入甲醛致BALB/c小鼠的骨髓损伤及其它器官的毒性作用

作　者: 叶新
导　师: 杨旭
学　校: 华中师范大学
专　业: 动物学
关键词: 甲醛氧化应激 DNA-蛋白质交联外周血单核细胞骨髓细胞流式细胞仪细胞周期
分类号: R114
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

甲醛,是一种主要的化工产品,广泛的存在于环境中,是…种常见的空气污染物。近年来甲醛已经被WHO (World Health Organization)组织划分为人类A1级别致癌物,已经明确指出甲醛可以导致鼻咽癌,引起哮喘等。并且美国NTP (National Toxicology Program)组织也已经将其划分为导致白血病的元凶,但是其导致远距离器官产生的毒性机理仍然不清楚,特别是其如何导致骨髓细胞中产生毒性机理的研究还值得去解决。本研究通过氧化应激反应平衡的变化来揭示这个问题。一、内环境甲醛浓度变化对BALB/c小鼠的毒性影响将不同浓度的甲醛溶液依据小鼠体重(6,12,18,30和60μg/g)通过尾静脉注射入小鼠体内,实验发现当BALB/c小鼠内的甲醛浓度平衡受到影响时,将会引起组织器官发生一系列的氧化应激反应,在肺、肝、脑、肾脏和骨髓细胞等器官都检测到氧化损伤情况的发生。其中活性氧自由基(Reactive oxygen species, ROS),除了肺组织外,在其他组织器官中均随着注射甲醛浓度的上升ROS值在不断增大。肺组织中没有检测到ROS增加,可能与其是呼吸的重要器官,组织结构有所不同,对ROS耐受性较强有关：对于膜脂过氧化重要的产物丙二醛(Malondialdehyde, MDA),发现组织器官随着注射甲醛浓度的上升MDA值在不断增大,并且在注射甲醛浓度为12μg/g时候,除脑组织以外肝,肺,肾和骨髓细胞中MDA值都是最大值;并且在反应细胞中DNA-蛋白质交联(DNA protein crosslinks, DPC)指标中,肝,肺,脑,肾和骨髓细胞,在浓度6～18μg/g时(在12μg/g时DPC值最高),DPC系数都随之增大,但在注射高浓度组30-60μg/g时反而减少。这些结果说明：1)微量的甲醛就能够导致机体内产生氧化应激反应从而导致机体器官的损伤,这是一个新发现。2)而且在微量甲醛的影响下,体内应该存在一个甲醛应答的阈值；从本实验来看,体内甲醛浓度达到12μg/g时似乎达到了这个闽值,引发连锁反应改变体内甲醛浓度的平衡。当注入体内甲醛浓度增大时,机体通过缓冲反应又可以清除氧化应激分子,使体内甲醛重新达到平衡。3)进而推测,短时间急性甲醛染毒应该能导致相关毒理反应。二、甲醛口鼻式气态染毒对小鼠和大鼠的影响对与甲醛的气态染毒而言,无论啮齿类动物如大小鼠,或灵长类动物恒河猴等等,都是可以用来做实验对象的,目前还没有论断到底那种动物是最好的动物模型,而且也没有专门的用于甲醛气态染毒的模式实验动物。目前国际上研究气态甲醛暴露问题的实验动物,大多数都选择的是大鼠(如Wistar大鼠)来进行实验的,用小鼠来做为动物模型进行甲醛毒性研究还比较少。本实验研究显示,在气态甲醛浓度为3.0mg/m3条件下,Wistar大鼠的体内多个器官特别是鼻腔和骨髓中明显可以检测出(与实验对照组相比)生物标志物的改变。活性氧自由基(ROS)水平上升,并且与之对应的DNA-蛋白质交联水平(DPC)也显著上升；并且抗氧化性化合物还原性谷胱甘肽(Glutathione, GSH)水平在骨髓,肺和脾脏组织中都发生显著下降。这些结果说明大鼠在3.0mg/m3浓度下组织器官还是受到了氧化损伤的影响,其中在骨髓和鼻腔中比较明显。在肺和脾脏中没有直接检测到ROS,DPC产生变化,但仍然能够发现在抗氧化系统中发现GSH水平产生了变化。在气态甲醛3.0mg/m3的暴露条件下,同样的状况也可以在BALB/c小鼠的试验中发现：在鼻腔和骨髓组织中(与对照组相比),ROS和DPC指标显著上升而抗氧化损伤指标GSH也与之对应的显著下降；在肺和脾脏组织中,ROS和DPC未检测出明显变化,但也仍然检测出GSH指标出现下降趋势。通过对比Wistar大鼠和BALB/c小鼠的ROS, GSH和DPC,我们可以推断在甲醛气态染毒实验中,大鼠和小鼠产生的由甲醛刺激造成氧化损伤情况大致相同。虽然以前甲醛气态染毒所用的实验对象大部分是在鼠,但本实验证明用BALB/c小鼠所获得的毒理特征儿乎与大鼠一致,可以很好的替代大鼠用于染毒实验。三、甲醛口鼻式气态染毒致小鼠的骨髓及远距离毒性影响本实验通过甲醛对BALB/c鼠在短期且模拟职业暴露条件(8h/d,7day)吸入染毒,检测了甲醛对小鼠骨髓细胞的毒性。通过ROS, MDA,GSH,DPC和甲醛浓度(FA)等指标检测了甲醛对小鼠骨髓细胞的氧化损伤,通过给小鼠依据100mg/kg体重灌胃注入GSH溶液,建立了甲醛毒性抑制组；利用RT-PCR检测了其对在骨髓细胞中的造血细胞生长分化起重要作用的转化生长因子(TGF-p)和造血生长因子(GM-Csf)的表达的影响；然后义检测了骨髓细胞周期变化,并且做了骨髓病理切片验证实验结果。发现随甲醛染毒浓度升高(0,0.5,1.0,3.0mg/m3),肺、肝和骨髓细胞中的ROS,MDA和DPC值极显著升高(P<0.01),并致GSH值下降(P<0.01)；肝和骨髓组织中FA值也随之升高,肺组织中FA值没有变化。而外周血淋巴单核细胞中这些指标儿乎都没有变化。而且加入GSH抑制组后,能显著的降低甲醛暴露导致的机体氧化损伤。通过RT-PCR结果也显示随吸入甲醛浓度的升高,TGF-P和GM-Csf的表达量也随之升高。并且我们通过对骨髓细胞周期的检测,骨髓病理切片的检测也印证了吸入甲醛确实能导致骨髓细胞损伤。总体来说以上结果可以证明甲醛能致使小鼠骨髓细胞产生损伤,以及其能致使远距离器官产生毒性作用。从基因以及细胞周期等方面向我们提示,高浓度的甲醛暴露有增加患白血病的风险。当然我们需要更多更充分的证据来证明甲醛暴露和白血病的关系。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-10
目录  10-13
第一章文献综述  13-34
  1.1 环境中的甲醛  13-15
    1.1.1 甲醛的理化性质  13-14
    1.1.2 甲醛的来源  14-15
  1.2 甲醛的暴露  15-19
    1.2.1 甲醛的暴露水平  15-17
    1.2.2 甲醛暴露的标记物  17-19
  1.3 甲醛的代谢机理  19-21
  1.4 甲醛与氧化应激  21-24
    1.4.1 氧化应激  21-23
    1.4.2 甲醛与氧化应激  23-24
  1.5 甲醛的遗传毒性研究  24-25
  1.6 甲醛与疾病  25-32
    1.6.1 甲醛与癌症研究  25-26
    1.6.2 甲醛与鼻咽癌  26-27
    1.6.3 甲醛与鼻窦癌  27-28
    1.6.4 甲醛与哮喘  28-29
    1.6.5 甲醛与白血病  29-31
    1.6.6 甲醛致癌机理  31-32
  1.7 甲醛研究与实验动物  32-33
  1.8 立题依据与研究意义  33-34
第二章内环境甲醛浓度变化对BALB/c小鼠的毒性影响  34-50
  2.1 实验材料  34-35
    2.1.1 实验动物  34
    2.1.2 主要实验仪器  34
    2.1.3 主要实验试剂  34
    2.1.4 主要实验溶液的配置  34-35
  2.2 实验方法  35-39
    2.2.1 样品处理  36
    2.2.2 活性氧(ROS)检测方法  36
    2.2.3 丙二醛(MDA)方法  36-37
    2.2.4 FOLIN-酚法测蛋白  37-38
    2.2.5 KCl-SDS法检测核酸蛋白交联(DPC)  38-39
  2.3. 数据统计分析  39
  2.4 实验结果  39-47
    2.4.1 ROS指标  39-42
    2.4.2 MDA指标  42-44
    2.4.3 DPC指标  44-47
  2.5 讨论  47-50
第三章甲醛口鼻式气态染毒对小鼠和大鼠的影响  50-57
  3.1 实验材料  50-51
    3.1.1 实验动物  50
    3.1.2 主要仪器  50
    3.1.3 主要试剂  50-51
  3.2 实验方法  51-52
    3.2.1 口鼻气态甲醛暴露染毒装置及染毒方案  51
    3.2.2 实验方案  51
    3.2.3 相关指标检测方法  51-52
  3.3 据统计分析  52
  3.4 实验结果  52-55
    3.4.1 大鼠的实验结果  52-54
    3.4.2 小鼠的实验结果  54-55
  3.5 讨论  55-57
第四章甲醛口鼻式气态染毒致小鼠的骨髓及远距离毒性影响  57-96
  4.1 实验材料  57-59
    4.1.1 实验动物  57
    4.1.2 主要仪器  57
    4.1.3 主要试剂  57-58
    4.1.4 主要实验溶液的配置  58-59
  4.2 实验方法  59-65
    4.2.1 气态甲醛暴露染毒方案  59
    4.2.2 外周血淋巴单核细胞的分离  59-60
    4.2.3 微量甲醛的测定方法  60
    4.2.4 阴性对照实验  60-61
    4.2.5 骨髓RNA的提取  61
    4.2.6 反转录PCR  61-62
    4.2.7 相关基因RT-PCR  62-63
    4.2.8 细胞碘化丙啶染色  63
    4.2.9 细胞周期检验  63-64
    4.2.10 骨骼切片制作  64
    4.2.11 苏木素-伊红染色  64-65
    4.2.12 过碘酸雪肤染色  65
  4.3 实验设计  65-67
  4.4 据统计分析  67
  4.5 实验结果  67-94
    4.5.1 口鼻气态甲醛染毒致不同组织氧化损伤  67-75
    4.5.2 不同组织中FA浓度和DPC的变化  75-80
    4.5.3 口鼻气态甲醛染毒氧化损伤抑制组的建立  80-83
    4.5.4 实验阴性对照的研究  83-86
    4.5.5 RT-PCR检测骨髓细胞中相关基因表达  86-89
    4.5.6 骨髓细胞细胞周期检测  89-90
    4.5.7 骨髓细胞病理观察切片  90-94
  4.6 讨论  94-96
第五章结论  96-98
  一、内环境甲醛浓度变化会对BALB/c小鼠产生毒性影响  96
  二、选择BALB/c小鼠或Wistar大鼠对气态甲醛暴露实验没有明显的影响  96-97
  三、甲醛口鼻式气态染毒能致小鼠的骨髓及远距离器官产生毒性影响  97-98
参考文献  98-113
博士期间发表文章  113-114
致谢  114-115

吸入甲醛致BALB/c小鼠的骨髓损伤及其它器官的毒性作用

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