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琼胶寡糖诱导坛紫菜抗性反应及其防御相关基因的研究

作　者: 朱竹君
导　师: 陈海敏
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 坛紫菜琼胶寡糖呼吸爆发氧化酶类似物脂氧合酶防御响应
分类号: S968.431
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

琼胶寡糖能作为一种外源性激发子诱导红藻坛紫菜的抗性反应。100μg/mL琼胶寡糖处理坛紫菜，在起始4min和10min左右出现两次氧呼吸增强，呼吸速率分别是基础呼吸的4倍和14.1倍。琼胶寡糖处理5min后，培养液里H2O2含量开始升高，在15min时达到峰值（102.1±6.82）nM，比对照组高出近10倍。H2O2积累能被10nM DPI部分抑制，说明活性氧产生与NADPH氧化酶相关。DCFH-DA荧光染色观察到活性氧产生在细胞膜上。2-AMAC荧光染色发现坛紫菜识别琼胶寡糖的位点在细胞膜上，并选择性识别聚合度为3和6的琼胶寡糖，对聚合度12的琼胶寡糖不响应。琼胶3糖和6糖能诱导坛紫菜产生氧化爆发，抑制其上附生菌生长，降低叶片腐烂率。同时，从坛紫菜叶状体基因组中克隆到两条防御相关基因，分别命名为Phrboh（坛紫菜呼吸爆发氧化酶类似物基因）和PhLOX（坛紫菜脂氧合酶基因）。目前得到的Phrboh完整ORF的全长为2853bp，可翻译成含951个氨基酸的蛋白。对Phrboh进行二级结构分析，发现其包含10个跨膜区域（TMD）。6个TMD位于蛋白N端，形成非血红素铁活性区域，H111、H125和H183、H197是四个保守的Fe配体残基。4个TMD位于蛋白C端，连接两个NADPH活性位点。 PhRboh与条斑紫菜PyRboh（ABA18724）非常保守，氨基酸同源性达到91%。但和角叉菜CcRboh（AAZ73480）的同源性相对较低，为35%。进化分析显示，藻类Rboh与动植物NADPH氧化酶的亲缘关系较远。以琼胶寡糖、琼胶3糖和6糖分别处理坛紫菜时，Phrboh均转录上调，指示其对坛紫菜氧化爆发响应有贡献。另一方面，克隆得到PhLOX（JX188386）的完整编码序列，共2697bp，可编码形成约98.7kD大小的蛋白。对其进行蛋白功能域分析，发现PhLOX由两个功能域组成。在其起始N端有一段约170aa的延伸区，属于SRPBCC超家族的功能域。而脂氧合酶活性功能域位于PhLOX的C端。H583、H588、H770、N774和I898是五个保守的非血红素Fe配体残基。A626与产物的立体构型相关，催化产生S型的氢过氧化产物。PhLOX与原红藻纲条斑紫菜PyLOX1和PyLOX2、紫紫菜PpLOX的相似性分别为31%、90%和54%，与真红藻纲角叉菜CcLOX和龙须菜GcLOX的相似性分别34%和41%。进化分析显示红藻类LOXs单独成簇，与原核生物、真菌类、植物类和哺乳动物类的LOX形成不同的进化分支。。通过原核表达联合HPLC/MS分析发现，PhLOX对亚油酸（LA）、亚麻酸（ALA）、花生四烯酸（ARA）和二十碳五烯酸（EPA）均表现催化活性。但当这四种底物同时存在时，PhLOX优先催化C20类。在琼胶寡糖诱导下，PhLOX转录水平上调，暗示其与坛紫菜防御响应时的oxylipins代谢相关。综上所述，在坛紫菜细胞膜上存在琼胶寡糖识别位点，选择性识别聚合度较小的琼胶寡糖。首先在细胞膜上响应氧化爆发，涉及NADPH氧化酶的参与。产生的活性氧既能抑制附生菌生长，又可以作为二级信号启动下游LOX代谢途径。本课题为藻类防御系统的研究提供了重要的实验依据。

全文目录

论文摘要  4-5
Abstract  5-8
引言  8-11
1 藻类防御系统的研究进展  11-16
  1.1 藻类天然免疫概述  11
  1.2 寡糖类物质在诱导藻类防御响应上的研究  11-13
    1.2.1 褐藻类的防御响应  11-12
    1.2.2 红藻类的防御响应  12-13
  1.3 藻类防御相关基因的研究  13-14
  1.4 藻类防御机制研究的展望  14-16
2 琼胶寡糖激发坛紫菜的防御响应  16-25
  2.1 材料与方法  16-17
    2.1.1 实验材料  16
    2.1.2 实验方法  16-17
  2.2 结果和分析  17-22
    2.2.1 琼胶寡糖诱导坛紫菜活性氧爆发  17-19
    2.2.2 琼胶寡糖聚合度对坛紫菜抗性激发的影响  19-21
    2.2.3 2-AMAC 标记琼胶寡糖观察坛紫菜细胞上糖结合位点  21-22
  2.3 讨论  22-23
  2.4 本章小结  23-25
3 坛紫菜呼吸爆发氧化酶类似物基因 PhRboh 的克隆和分析  25-34
  3.1 材料和方法  25-29
    3.1.1 实验材料  25
    3.1.2 实验方法  25-29
  3.2 结果与分析  29-33
    3.2.1 PhRboh 的全长序列及分析  29-32
    3.2.2 琼胶寡糖诱导下 PhRboh 的转录调控  32-33
  3.3 讨论  33
  3.4 本章小结  33-34
4 坛紫菜脂氧合酶基因 PhLOX 的克隆与原核表达分析  34-49
  4.1 材料与方法  34-38
    4.1.1 实验材料  34
    4.1.2 实验方法  34-38
  4.2 结果与分析  38-48
    4.2.1 PhLOX 的全长序列及分析  38-46
    4.2.2 PhLOX 的原核表达和纯化  46
    4.2.3 HPLC/MS 分析 PhLOX 的催化活性  46-47
    4.2.4 琼胶寡糖诱导下 PhLOX 的转录调控  47-48
  4.3 讨论  48
  4.4 本章小结  48-49
5 结论  49-50
参考文献  50-54
在学研究成果  54-55
致谢  55

琼胶寡糖诱导坛紫菜抗性反应及其防御相关基因的研究

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