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灿烂弧菌感染刺参过程中相关MicroRNA的克隆与表达研究

作 者: 冯维达
导 师: 金春华;李成华
学 校: 宁波大学
专 业: 海洋生物学
关键词: 刺参 腐皮综合症 微小RNA 灿烂弧菌 荧光定量PCR
分类号: S947.9
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


腐皮综合症以其传播快、死亡率高、分布广等特点成为制约刺参产业发展的主要瓶颈。目前对于该病发生机制却很少涉足,对于病原如何逃避宿主免疫系统的监视而实现体内扩增和繁殖等内在信号调控网络也知之甚少,极大的限制了针对该病症的免疫防治制剂的开发。MicroRNA(miRNA)是一类21-25个核苷酸的小分子非编码调控RNA,以类似RNAi的途径以单链的RNA参与调控诸多的生命过程的关键基因。被认为是解答宿主和病原相互作用机制的突破口。本研究利用实验室建立的miRNA克隆策略,分离纯化灿烂弧菌感染前后刺参体腔细胞中19nt至24nt大小的小分子RNA,逆转录成cDNA后,连接Illumina特异性接头,构建刺参腐皮综合症发生前后体腔细胞miRNA的克隆文库,利用llumina Hiseq2000测序平台的单端2x50bp模式进行高通量测序;同时,选定特定miRNA进行定量PCR验证。实验结果如下:去掉接头和低质量的序列,对照组和感染组分别得到了9,579,038和7,742,558个阅读数;通过与海胆参考基因库比较,分别得到了567,446和515,172个阅读数;通过与miRase数据库比较,得到了304,378和223,791个阅读数;最后,经过与Rfam数据库进一步比对,分别获得了302,399和222,605个阅读数,并且最终从两个库中找到了40个保守的miRNAs,其中推测let-7和mir-125在两个文库阅读数比值相近,推测两者可能隶属于同一个表达群是聚集在一起并作出相应的表达。通过搜索参考基因库和茎环结构的预测,确定筛选了34个新型miRNAs候选基因。并且根据基于FPKM模型的差异表达分析显示mir-31和mir-2008在两个库中表达量有重大的差异,推测两者可能参与了刺参腐皮综合症发生的调控。利用Real-time PCR技术,根据高通量测序的结果,选择对mir-31、mir-34、mir-242、mir-375、mir-2008、mir-2012为主要研究对象,在病原菌灿烂弧菌(Vibrio splendidus)感染后的表达水平进行了分析,其中mir-242,mir-2008,mir-31,mir-375的表达量均为先升后降,mir-34,mir-2012的表达量一直成下降趋势。本研究为认识和掌握miRNA在调控刺参腐皮综合症发生的内在分子调控机制提供了参考,研究结果为下一步开发针对性的该疾病免疫防治制剂提供帮助。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章 绪论  12-24
  1 刺参  12-13
    1.1 分类地位与特征  12
    1.2 刺参养殖业在我国水产业中的重要地位  12-13
  2 刺参腐皮综合症  13-15
    2.1 腐皮综合症特征  13-14
    2.2 研究现状  14-15
  3 miRNAs  15-18
    3.1 miRNA 简介  15-16
    3.2 研究现状  16-17
    3.3 microRNA 的研究前景  17-18
  4 高通量测序  18-21
    4.1 高通量测序原理  18-19
      4.1.1 Sanger370 测序法  18
      4.1.2 454 测序仪  18
      4.1.3 Solexa 基因组分析平台  18-19
      4.1.4 SOLID 测序仪  19
    4.2 高通量测序的应用  19-21
      4.2.1 高通量测序在动植物中的应用  19-20
      4.2.2 高通量测序在微生物学研究中的应用  20
      4.2.3 高通量测序在表观遗传上的应用  20
      4.2.4 高通量测序在 miRNA 的应用  20-21
  5 荧光定量 PCR  21-23
    5.1 荧光定量 PCR 原理  21
    5.2 荧光定量 PCR 技术特点  21-23
    5.3 荧光定量 PCR 在海洋生物中的应用  23
  6 立题背景及意义  23-24
第二章 miRNA 克隆文库的构建  24-39
  1 材料与方法  24-30
    1.1 材料  24
    1.2 方法  24-30
      1.2.1 文库的制备  24-27
      1.2.2 生物信息学分析  27-30
  2 结果与讨论  30-39
    2.1 miRNA 文库的构建  30-31
    2.2 miRNA 的高通量测序  31-32
    2.3 保守 miRNAs 筛选  32-34
    2.4 新颖 miRNA 的预测  34-37
    2.5 miRNAs 的表达分析  37-39
第三章 灿烂弧菌感染刺参过程中主要miRNA 的表达研究  39-46
  1 材料和方法  39-42
    1.1 材料  39
    1.2 实验方法  39-42
      1.2.1 灿烂弧菌的培养  39
      1.2.2 刺参感染实验  39
      1.2.3 miRNA 定量 PCR 的检测  39-41
      1.2.4 荧光结果的处理  41-42
  2 结果与讨论  42-46
总结与展望  46-47
参考文献  47-54
附录A 附录在学研究成果  54-55
致谢  55

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 其他水产病虫害及其防治 > 其他
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