学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

拟态弧菌模拟表位的串联表达及其对草鱼的免疫应答研究

作　者: 张玉晴
导　师: 李槿年
学　校: 安徽农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 拟态弧菌模拟表位串联肽免疫相关基因表达水平抗体水平免疫保护效应
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 16次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

拟态弧菌可引起水产动物的腹水病，严重危害水产养殖业的健康发展，但目前尚无疫苗用于该病预防。本实验室前期研究已证实外膜蛋白U（OmpU）是拟态弧菌保守性黏附素蛋白之一，该蛋白对实验小鼠的免疫保护率为60%。同时，筛选鉴定出OmpU蛋白的6个免疫优势B细胞模拟表位，但模拟表位串联肽的免疫效应尚不清楚。本研究的总体思路是设计和表达OmpU蛋白模拟表位串联肽，综合评价其免疫效应，以期获得免疫保护效应较OmpU蛋白有所提高的多表位肽。首先，根据OmpU蛋白模拟表位序列及多表位串联肽设计原则，优化设计模拟表位串联肽。即用AAY（丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸）接头将已鉴定获得的OmpU蛋白6个模拟表位按不同方式串联，应用DNAStarProtean软件分析各种串联方式的可行性，结果发现以C25-AAY-C17-AAY-C60-AAY-C20-AAY-C66-AAY-C24方式排列的多表位肽中各表位间相对独立，抗原性参数较好，为最佳串联方式。将此多表位串联肽序列转化为基因序列，并在基因序列两端添加酶切位点，终止密码子以及替换稀有密码子，形成一个长度为264bp的多表位串联基因（命名为6epis基因），委托生物公司克隆至质粒pMAL-c4X中。其次，大量制备模拟表位串联肽，为综合评价其免疫效应提供试验材料。应用基因重组技术构建重组表达质粒pET-32a-6epis，转化至E.coliRosetta进行大量诱导表达，进而使用Ni-ChargedResin亲合层析柱纯化重组蛋白His-6EPIS。经SDS-PAGE和Western-blot分析，发现制备的重组蛋白浓度为1.5mg/mL，纯度达到95%，能与兔抗OmpU抗体发生特异性反应，仍保留天然蛋白的抗原性。最后，以制备的重组模拟表位串联蛋白、重组OmpU蛋白、标签蛋白和灭活菌苗分别免疫实验鱼，通过测定免疫器官中免疫相关基因表达水平、血清抗体产生水平和免疫动物的保护水平，综合评价其免疫效应。结果显示：（1）6EPIS免疫组草鱼头肾和脾脏中IgMmRNA的表达水平具有明显时间依赖性，免疫后3d开始逐渐升高，至28d达到高峰，攻毒后头肾和脾脏中IgMmRNA表达水平迅速上升，分别较免疫前提高28倍和54倍(p<0.01)。OmpU组、灭活菌组和标签蛋白组草鱼免疫后组织中IgMmRNA转录水平的动力学与重组6EPIS组相似，两因素方差分析结果表明：重组6EPIS组头肾和脾脏中IgMmRNA转录整体水平均显著高于重组OmpU组、灭活菌组和His标签蛋白组的头肾和脾脏（p<0.05），而重组OmpU组、灭活菌组和His标签蛋白组的IgMmRNA转录整体水平无显著差异（p>0.05）。（2）草鱼头肾和脾脏中促炎细胞因子（IL-1β和TNF-α）mRNA表达水平于首次免疫和加强免疫后的第1d上调至极显著水平(p<0.001)，但攻毒后的表达水平与对照组差异不显著(p>0.05)。重-I组6EPIS组促炎细胞因子的整体转录水平显著高于重组OmpU组、灭活菌组和标签蛋白组(p<0.01)，且重组OmpU组和灭活菌组均显著高于标签蛋白组(p<0.01)，但两组之间差异不显著(p>0.05)。（3）免疫草鱼脾脏和头肾中抗炎性细胞因子IL-10mRNA表达水平轻微下调，但在攻毒后，表达水平显著上调(p<0.01)，6EPIS组、OmpU组、灭活菌组促炎细胞因子的整体转录水平显著高于标签蛋白组(p<0.01)，但是三组之间的差异不显著(p>0.05)。（4）重组模拟表位串联蛋白能够良好诱导鱼体产生特异性抗体，其免疫后28天琼扩效价为1:16，同时，OmpU组和灭活菌组的血清抗体效价为1:4和1:8，标签蛋白组未检测到针对6EPIS和细菌的特异性抗体。（5）免疫后30天，以10LD50拟态弧菌攻击免疫鱼，结果发现重组模拟表位串联蛋白、重组OmpU蛋白及灭活拟态弧菌对草鱼的免疫保护率分别为86.67%、66.67%和76.67%。综上所述，OmpU蛋白模拟表位串联肽具有良好的诱导免疫应答能力和免疫保护效应，是理想的疫苗侯选抗原。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
常用中英文缩略词  10-11
文献综述  11-20
引言  20-22
1 材料与方法  22-32
  1.1 实验菌株与质粒  22
  1.2 酶类与主要试剂（盒）  22
  1.3 实验动物与饲养  22-23
  1.4 主要培养基和溶液配制  23-25
    1.4.1 主要培养基的配制  23
    1.4.2 感受态细胞制备及转化用溶液  23
    1.4.3 SDS-PAGE电泳所需溶液  23-24
    1.4.4 蛋白表达及提纯所需溶液  24-25
    1.4.5 Western-Blot所用溶液  25
  1.5 主要仪器  25-26
  1.6 模拟表位串联基因的设计与合成  26
  1.7 重组模拟表位串联肽r6EPIS的制备  26-28
    1.7.1 重组质粒及表达质粒双酶切  26
    1.7.2 目的基因与表达质粒的连接  26-27
    1.7.3 连接产物的转化  27
    1.7.4 重组表达质粒的鉴定  27
    1.7.5 诱导表达  27
    1.7.6 表达产物的鉴定  27-28
    1.7.7 表达形式分析  28
    1.7.8 重组蛋白的纯化  28
  1.8 模拟表位串联肽诱导草鱼的免疫应答  28-31
    1.8.1 免疫原制备  28-29
    1.8.2 实验草鱼分组与免疫程序  29
    1.8.3 组织样品的采集  29
    1.8.4 血清样品的采集  29
    1.8.5 免疫相关基因mRNA表达水平的检测  29-31
  1.9 血清抗体水平测定  31
  1.10 模拟表位串联肽对草鱼免疫保护性的测定  31-32
    1.10.1 拟态弧菌安徽分离株LD50测定  31
    1.10.2 免疫草鱼的攻毒保护性试验  31-32
2 结果与分析  32-45
  2.1 模拟表位串联基因的设计与合成  32-33
  2.2 重组模拟表位串联肽r6EPIS的制备  33-35
  2.3 荧光定量PCR反应体系与条件的优化  35-37
  2.4 荧光定量PCR标准曲线的建立  37-38
  2.5 草鱼免疫与攻毒后IgM的mRNA表达水平  38-40
  2.6 草鱼免疫与攻毒后特异性抗体水平  40-41
  2.7 草鱼免疫与攻毒后细胞因子的mRNA表达水平  41-43
  2.8 拟态弧菌安徽分离株的LD50测定结果  43-44
  2.9 模拟表位串联肽的免疫保护性  44-45
3 讨论  45-48
  3.1 表位选择与表位疫苗的设计  45-46
  3.2 模拟表位串联肽6EPIS对草鱼IgM表达的影响  46
  3.3 模拟表位串联肽6EPIS对草鱼细胞因子表达的影响  46-48
结论  48-49
参考文献  49-54
附录  54-56
致谢  56-57
作者简介  57

拟态弧菌模拟表位的串联表达及其对草鱼的免疫应答研究

内容摘要

全文目录

相似论文