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香鱼IL-12B基因与鳗利斯顿氏菌感染相关性
作 者: 沈广强
导 师: 陈炯
学 校: 宁波大学
专 业: 海洋生物学
关键词: 白介素-12B 香鱼 鳗利斯顿氏菌 基因表达
分类号: S943
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
白介素-12B(Interleukin-12B、IL-12B)是组成IL-12分子的一个亚单位,主要由抗原呈递细胞表达分泌; IL-12分子作为异二聚体结构的免疫调剂细胞因子,是联系早期先天性免疫和后续获得性免疫的关键纽带,具有激活NK细胞并诱导其分泌IFN-γ和促进CD4+T细胞向TH1细胞分化等功能,参与病原体感染引起的免疫反应。本文通过香鱼巨噬细胞转录组测序获得香鱼IL-12B的cDNA序列,包括完整的开放阅读框在内,序列大小为1152bp,预测编码的前体蛋白由303个氨基酸组成,相对分子质量为33.5kDa。IL-12B蛋白N-端有22个氨基酸残基的信号肽序列和四个保守的半胱氨酸残基,C-端有一保守的WSXWS基序。通过氨基酸序列比对分析和构建进化树发现,香鱼IL-12B与大西洋鲑IL-12B进化关系最近,同源性为50%。组织表达差异分析表明,香鱼IL-12B基因mRNA在健康香鱼头肾组织中表达量最高,肠、脾脏和鳃等组织也有少量表达。荧光定量PCR分析揭示,鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)感染后,香鱼头肾组织和外周血白细胞IL-12B基因mRNA表达显著上调,12hpi时达到峰值。利用原核表达系统,构建原核表达载体pET-28a-sIL-12B,通过转化构建表达菌株,经IPTG诱导表达,成功获得大量IL-12B蛋白,目的蛋白经KCl法纯化后,免疫小鼠,成功制备香鱼IL-12B抗血清。随后进行Western blot检测,结果表明,香鱼血清中IL-12B蛋白表达量在鳗利斯顿氏菌感染香鱼后上调,伴随感染时间延长表达量不断增加,感染后24hpi时达到对照组4倍。综上,香鱼IL-12B基因的表达变化与鳗利斯顿氏菌感染过程密切相关,揭示香鱼IL-12B基因可能在病原菌感染引起的免疫反应中发挥重要作用。
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全文目录
摘要 4-5 Abstract 5-6 目录 6-8 引言 8-10 1 IL-12B 基因研究进展 10-17 1.1 IL-12 10-14 1.1.0 IL-12 分子结构 11 1.1.1 IL-12 的信号通路 11-13 1.1.2 IL-12 生物功能 13-14 1.2 IL-12B 14-16 1.2.1 IL-12B 的研究现状 15-16 1.3 小结 16-17 2 香鱼 IL-12B 基因序列分析及其克隆 17-26 2.1 实验材料 17-18 2.1.1 菌种与克隆载体 17 2.1.2 实验动物 17-18 2.1.3 试剂与工具酶 18 2.1.4 仪器 18 2.2 实验方法 18-22 2.2.1 提取总 RNA 和合成 cDNA 18 2.2.2 香鱼 IL-12B 基因 T-A 克隆 18-22 2.3 结果与分析 22-25 2.3.1 香鱼 IL-12B 基因序列分析 22-24 2.3.2 香鱼 IL-12B mRNA 的组织表达特征 24-25 2.4 讨论 25-26 3 制备香鱼 IL-12B 抗血清 26-32 3.1 实验材料与方法 26-29 3.1.1 实验材料 26 3.1.2 实验方法 26-29 3.2 分析实验结果 29-31 3.2.1 构建原核表达载体 29-30 3.2.2 诱导重组质粒表达 30-31 3.2.3 验证抗血清 31 3.3 讨论 31-32 4 鳗利斯顿氏菌感染实验及 Real-Time qPCR 32-38 4.1 实验材料与方法 33-36 4.1.1 实验材料 33 4.1.2 方法 33-36 4.2 结果与分析 36-37 4.2.1 香鱼 IL-12B 基因在鳗利斯顿氏菌感染前后头肾组织 mRNA 转录水平的表达差异 36-37 4.2.2 香鱼 IL-12B 基因在鳗利斯顿氏菌侵染前后蛋白质水平表达变化 37 4.3 讨论 37-38 5 结论 38-40 5.1 本研究的成果 38-39 5.2 展望 39-40 参考文献 40-45 在学研究成果 45-46 致谢 46
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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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