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香鱼IL-12B基因与鳗利斯顿氏菌感染相关性

作 者: 沈广强
导 师: 陈炯
学 校: 宁波大学
专 业: 海洋生物学
关键词: 白介素-12B 香鱼 鳗利斯顿氏菌 基因表达
分类号: S943
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


白介素-12B(Interleukin-12B、IL-12B)是组成IL-12分子的一个亚单位,主要由抗原呈递细胞表达分泌; IL-12分子作为异二聚体结构的免疫调剂细胞因子,是联系早期先天性免疫和后续获得性免疫的关键纽带,具有激活NK细胞并诱导其分泌IFN-γ和促进CD4+T细胞向TH1细胞分化等功能,参与病原体感染引起的免疫反应。本文通过香鱼巨噬细胞转录组测序获得香鱼IL-12B的cDNA序列,包括完整的开放阅读框在内,序列大小为1152bp,预测编码的前体蛋白由303个氨基酸组成,相对分子质量为33.5kDa。IL-12B蛋白N-端有22个氨基酸残基的信号肽序列和四个保守的半胱氨酸残基,C-端有一保守的WSXWS基序。通过氨基酸序列比对分析和构建进化树发现,香鱼IL-12B与大西洋鲑IL-12B进化关系最近,同源性为50%。组织表达差异分析表明,香鱼IL-12B基因mRNA在健康香鱼头肾组织中表达量最高,肠、脾脏和鳃等组织也有少量表达。荧光定量PCR分析揭示,鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)感染后,香鱼头肾组织和外周血白细胞IL-12B基因mRNA表达显著上调,12hpi时达到峰值。利用原核表达系统,构建原核表达载体pET-28a-sIL-12B,通过转化构建表达菌株,经IPTG诱导表达,成功获得大量IL-12B蛋白,目的蛋白经KCl法纯化后,免疫小鼠,成功制备香鱼IL-12B抗血清。随后进行Western blot检测,结果表明,香鱼血清中IL-12B蛋白表达量在鳗利斯顿氏菌感染香鱼后上调,伴随感染时间延长表达量不断增加,感染后24hpi时达到对照组4倍。综上,香鱼IL-12B基因的表达变化与鳗利斯顿氏菌感染过程密切相关,揭示香鱼IL-12B基因可能在病原菌感染引起的免疫反应中发挥重要作用。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-6
目录  6-8
引言  8-10
1 IL-12B 基因研究进展  10-17
  1.1 IL-12  10-14
    1.1.0 IL-12 分子结构  11
    1.1.1 IL-12 的信号通路  11-13
    1.1.2 IL-12 生物功能  13-14
  1.2 IL-12B  14-16
    1.2.1 IL-12B 的研究现状  15-16
  1.3 小结  16-17
2 香鱼 IL-12B 基因序列分析及其克隆  17-26
  2.1 实验材料  17-18
    2.1.1 菌种与克隆载体  17
    2.1.2 实验动物  17-18
    2.1.3 试剂与工具酶  18
    2.1.4 仪器  18
  2.2 实验方法  18-22
    2.2.1 提取总 RNA 和合成 cDNA  18
    2.2.2 香鱼 IL-12B 基因 T-A 克隆  18-22
  2.3 结果与分析  22-25
    2.3.1 香鱼 IL-12B 基因序列分析  22-24
    2.3.2 香鱼 IL-12B mRNA 的组织表达特征  24-25
  2.4 讨论  25-26
3 制备香鱼 IL-12B 抗血清  26-32
  3.1 实验材料与方法  26-29
    3.1.1 实验材料  26
    3.1.2 实验方法  26-29
  3.2 分析实验结果  29-31
    3.2.1 构建原核表达载体  29-30
    3.2.2 诱导重组质粒表达  30-31
    3.2.3 验证抗血清  31
  3.3 讨论  31-32
4 鳗利斯顿氏菌感染实验及 Real-Time qPCR  32-38
  4.1 实验材料与方法  33-36
    4.1.1 实验材料  33
    4.1.2 方法  33-36
  4.2 结果与分析  36-37
    4.2.1 香鱼 IL-12B 基因在鳗利斯顿氏菌感染前后头肾组织 mRNA 转录水平的表达差异  36-37
    4.2.2 香鱼 IL-12B 基因在鳗利斯顿氏菌侵染前后蛋白质水平表达变化  37
  4.3 讨论  37-38
5 结论  38-40
  5.1 本研究的成果  38-39
  5.2 展望  39-40
参考文献  40-45
在学研究成果  45-46
致谢  46

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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