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葡萄球菌诱导斑马鱼皮肤免疫相关基因差异表达的研究

作　者: 王艺
导　师: 李槿年
学　校: 安徽农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 斑马鱼皮肤黏膜基因芯片差异表达免疫相关基因
分类号: S942
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

鱼类皮肤黏膜是黏膜免疫系统的重要组成部分，越来越多的研究表明鱼类皮肤黏膜可独立完成抗原摄取、递呈及分泌抗体等功能，在鱼类抵抗外来病原侵袭方面发挥着极其重要的作用，但其在免疫应答过程中表达的免疫相关基因目前尚不完全清楚。本研究的总体思路是利用基因芯片技术检测经致死剂量产色葡萄球菌处理和未处理的斑马鱼(Danio rerio)皮肤，检测和分析感染后斑马鱼免疫应答早期皮肤组织差异表达基因，以挖掘出斑马鱼皮肤免疫早期相关功能基因的详实数据信息，为研究鱼类皮肤黏膜的免疫机制和研发浸泡免疫疫苗奠定基础。首先，从草鱼肠道分离鉴定致病性产色葡萄球菌，为后续试验提供菌种。采用常规细菌分离培养方法结合人工感染试验从草鱼肠黏膜分离获得一株致病菌，命名为SC1菌株。根据其染色特性和菌落特征进行初步鉴定；然后采用分子生物学方法，对其16S rRNA基因和过氧化氢酶基因(kat)进行扩增和序列分析。结果表明，该菌为G+球菌，呈葡萄串状排列，无荚膜和芽孢，其生化特性等与葡萄球菌属(Staphylococcus)相吻合，分离菌株16S rRNA基因和kat基因PCR扩增产物分别为1520bp和1232bp，序列分析分析表明它们在遗传距离上与产色葡萄球菌(Staphylococcus chromogenes)最为接近，从而SC1菌株为产色葡萄球菌。其次，建立实验动物斑马鱼的感染模型。以斑马鱼为实验动物，感染剂量、时间为参数，进行产色葡萄球菌人工感染斑马鱼试验，通过观察感染后斑马鱼的发病死亡情况以及组织病理学变化，确定其最佳感染条件。结果发现以108CFU/mL菌液浓度浸泡感染10min后斑马鱼的活动状态比较一致，出现了游动缓慢和浮头现象，并且死亡时间相对较为集中。病理学变化主要表现为肾脏细胞坏死、核内染色质浓缩、染色加深并伴有炎症细胞浸润；肝脏细胞排列疏松、染色加深、伴有炎症细胞浸润。由此可见，该感染条件是产色葡萄球菌人工感染斑马鱼的最佳条件。最后，以斑马鱼感染模型为研究对象，利用基因芯片技术从皮肤组织中抽提总RNA，经生物素(Biotin)标记后，与包含15617个cDNA探针的斑马鱼表达谱基因芯片杂交，在斑马鱼免疫应答早期，检测皮肤免疫相关差异表达基因，并进行功能聚类、注释分析和通路分析。结果共检测出272个差异表达基因，其中210个为上调表达基因，62个下调表达基因。利用NCBI、MAS等数据库对差异基因进行功能聚类和注释分析，结果显示272个差异表达基因中，134个为已知功能基因，具有免疫功能的基因有10个，主要包括凝集素基因(lgals1l3）、组织相容性复合体(mhc1uea、mhc1ufa)、谷胱甘肽氧化物酶基因(gpx1b)、转铁蛋白基因(tfa)、凝血因子(f5)、硒蛋白基因(sepw2b)、补体(cfb)(均为上调表达)；肿瘤坏死因子基因(tnfsf10l4)和卵黄蛋白原基因(vtg3)(均为下调表达)。它们涉及的免疫反应包括病原体识别、抗原加工与提呈、补体激活和特异性免疫应答。通路分析结果显示p53信号通路、ErbB受体信号转导通路和JAK-STAT信号转导通路等9个通路均参与斑马鱼皮肤抗产色葡萄球菌感染。综上所述，本研究挖掘出10个经产色葡萄球菌诱导后的斑马鱼皮肤组织免疫相关的差异表达基因，明确了这些免疫相关基因参与的免疫反应。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
图表目录  10-12
本论文常用中英文缩写词  12-14
文献综述  14-24
引言  24-26
1 材料与方法  26-33
  1.1 实验菌株  26
  1.2 酶类与主要试剂（盒）  26
  1.3 实验动物  26
  1.4 主要培养基与溶液的配制  26-28
    1.4.1 主要培养基  26
    1.4.2 琼脂糖凝胶电泳所需溶液  26-27
    1.4.3 制备感受态细胞所需溶液  27
    1.4.4 石蜡切片制备所需溶液  27
    1.4.5 基因芯片所需溶液  27-28
  1.5 主要仪器  28-29
  1.6 产色葡萄球菌的分离鉴定  29-30
    1.6.1 细菌的分离培养与纯化  29
    1.6.2 分离菌的鉴定  29-30
    1.6.3 分离菌的致病性分析  30
  1.7 产色葡萄球菌感染斑马鱼实验模型建立  30-32
    1.7.1 斑马鱼的饲养  30
    1.7.2 细菌培养与浓度测定  30
    1.7.3 人工感染斑马鱼试验  30-31
    1.7.4 感染鱼的组织病理学检查  31-32
  1.8 基因芯片检测皮肤免疫相关差异表达基因  32-33
    1.8.1 斑马鱼皮肤组织的采取  32
    1.8.2 基因芯片  32
    1.8.3 RNA 提取、cRNA 合成、标记和芯片杂交  32
    1.8.4 芯片扫描和数据处理分析  32-33
2 结果与分析  33-42
  2.1 产色葡萄球菌的分离鉴定  33-35
    2.1.1 病原菌的分离与纯化  33
    2.1.2 SC1 菌株的形态特征与生化特性  33-34
    2.1.3 SC1 菌株的 16Sr RNA 和 kat 基因序列与系统发育进化树分析  34
    2.1.4 菌种归类判定  34-35
  2.2 斑马鱼感染模型的建立  35-38
    2.2.1 感染途径的确定  35-36
    2.2.2 浸泡感染剂量与浸泡时间的确定  36-37
    2.2.3 感染斑马鱼的组织病理学变化  37-38
  2.3 基因芯片检测皮肤免疫相关差异表达基因  38-42
    2.3.1 差异表达基因检测结果  38-39
    2.3.2 差异基因功能聚类分析  39-40
    2.3.3 差异表达基因所在通路分析  40-42
3 讨论  42-45
  3.1 斑马鱼感染模型的建立  42
  3.2 产色葡萄球菌诱导的皮肤免疫相关差异表达基因  42-44
  3.3 差异表达基因的通路分析  44-45
结论  45-46
参考文献  46-52
附录  52-67
致谢  67-68
作者简介  68

葡萄球菌诱导斑马鱼皮肤免疫相关基因差异表达的研究

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