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鳗弧菌快速检测试纸条的研制
作 者: 吴园园
导 师: 张元兴
学 校: 华东理工大学
专 业: 生物化工
关键词: 鳗弧菌 胶体金 量子点 上转磷光 快速检测试纸条
分类号: S941
类 型: 硕士论文
年 份: 2014年
下 载: 36次
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内容摘要
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种可引起鱼类高致死性出血性败血症的病原菌,给水产养殖业带来巨大危害和经济损失,迫切需要建立一种准确、便捷的鳗弧菌检测方法用于疾病的防控。目前文献已报道的鳗弧菌检测方法存在检测时间长、操作过程复杂等问题,无法应用于养殖渔场等基层单位。本课题基于抗体标记技术开发以胶体金、量子点及上转磷光材料作为标记物的快速免疫层析法检测鳗弧菌,为鳗弧菌病害的防控提供便捷的检测方法。本课题以实验室分离的一株鳗弧菌毒株MVM425灭活菌体为抗原,制备鳗弧菌单克隆抗体5G4-G4和5G4-B8。以胶体金作为标记材料对鳗弧菌单克隆抗体进行标记,制备出鳗弧菌胶体金快速检测试纸条。该试纸条具有良好的特异性,与弧菌属常见的病原菌无交叉反应,其检测限达到105CFU/ml。据文献报道以量子点和上转磷光材料作为抗体标记物,可以大幅度提高检测灵敏度,实现对病原微生物的微量和定量检测。本课题考察了核-壳型量子点材料CdSe/ZnS和上转磷光材料NaYF4:Yb, Er作为抗体标记物在鳗弧菌检测中应用的可行性。通过优化抗体与这两种材料的最佳结合量,获得量子点和上转磷光材料标记鳗弧菌单克隆抗体,并以斑点杂交验证其应用于鳗弧菌检测的可行性,为后续研发量子点及上转磷光检测试纸条奠定了基础。
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全文目录
摘要 5-6 Abstract 6-10 第1章 文献综述 10-19 1.1 鳗弧菌 10 1.2 鳗弧菌的检测方法 10-12 1.2.1 基于细菌培养及生理生化指标检测的方法 10 1.2.2 基于免疫及分子生物学技术的检测方法 10-12 1.3 基于免疫层析技术的快速检测试纸条 12-13 1.3.1 快速检测试纸条 12 1.3.2 快速检测纸条的原理和结构 12-13 1.3.3 快速检测试纸条在病原菌检测方面的应用 13 1.4 抗体标记物 13-18 1.4.1 纳米金颗粒 13-15 1.4.2 量子点 15-16 1.4.3 上转磷光材料 16-18 1.5 本课题的主要内容和意义 18-19 第2章 鳗弧菌单克隆抗体的制备 19-31 2.1 前言 19 2.2 材料 19-21 2.2.1 细胞、细菌及实验动物 19 2.2.2 主要实验试剂与缓冲液 19-21 2.3 实验方法 21-27 2.3.1 制备灭活菌液 21 2.3.2 Sp2/0细胞的复苏 21 2.3.3 采集阴性血清 21 2.3.4 免疫小鼠 21-22 2.3.5 测定血清中抗体效价的方法 22 2.3.6 准备饲养细胞 22-23 2.3.7 细胞融合 23-24 2.3.8 融合细胞的培养 24 2.3.9 筛选阳性杂交瘤细胞株 24-25 2.3.10 杂交瘤细胞株的去交叉反应 25 2.3.11 杂交瘤细胞株的克隆 25-26 2.3.12 杂交瘤细胞株的冻存 26 2.3.13 单克隆抗体的纯化 26 2.3.14 抗体的亚型鉴定 26-27 2.3.15 单克隆抗体的效价检测 27 2.3.16 单克隆抗体的浓度测定 27 2.4 实验结果 27-29 2.4.1 小鼠的免疫 27 2.4.2 细胞融合及去交叉反应结果 27-28 2.4.3 杂交瘤细胞的克隆及去交叉反应结果 28 2.4.4 单克隆抗体的亚型测定 28-29 2.4.5 单克隆抗体的效价测定 29 2.4.6 单克隆抗体的浓度测定 29 2.5 讨论 29-30 2.6 结论 30-31 第3章 鳗弧菌胶体金快速检测试纸条的制备 31-44 3.1 前言 31 3.2 材料 31 3.2.1 细菌及实验动物 31 3.2.2 主要实验试剂与材料 31 3.3 实验方法 31-36 3.3.1 多克隆抗体的制备 31-32 3.3.2 多克隆抗体蛋白浓度的测定 32 3.3.3 制备胶体金溶液 32 3.3.4 胶体金溶液与抗体的结合 32-33 3.3.5 胶体金快速检测试纸条的制备 33-34 3.3.6 胶体金快速检测试纸条性能检测 34-35 3.3.7 与多重PCR检测方法的比较 35-36 3.4 实验结果 36-42 3.4.1 多克隆抗体效价 36 3.4.2 胶体金溶液的制备 36-37 3.4.3 胶体金溶液与抗体的结合 37 3.4.4 抗体配对结果 37-38 3.4.5 胶体金快速检测试纸条的性能测定 38-41 3.4.6 胶体金快速检测试纸条与多重PCR检测方法的比较 41-42 3.5 讨论 42-43 3.6 结论 43-44 第4章 量子点和上转磷光材料的应用探索 44-54 4.1 前言 44 4.2 材料 44 4.2.1 菌株 44 4.2.2 主要实验试剂与材料 44 4.3 实验方法 44-47 4.3.1 量子点与抗体的结合 44-45 4.3.2 量子点与抗体结合的验证 45 4.3.3 量子点与抗体的最佳结合量 45 4.3.4 斑点免疫实验验证量子点标记抗体的检测性能 45-46 4.3.5 量子点快速检测试纸条的研制 46-47 4.3.6 上转磷光材料与抗体的结合 47 4.3.7 上转磷光材料与抗体结合的验证及最佳结合量确定 47 4.3.8 上转磷光与抗体快速检测试纸条的研制 47 4.4 实验结果 47-52 4.4.1 量子点标记抗体的验证结果 47-48 4.4.2 量子点与抗体的最佳结合量 48-49 4.4.3 斑点杂交实验考察量子点标记抗体的检测性能 49-50 4.4.4 量子点快速检测试纸条的研制 50-51 4.4.5 上转磷光材料与抗体结合的验证及最佳结合量确定 51 4.4.6 上转磷光材料快速检测试纸条的研制 51-52 4.5 讨论 52-53 4.6 结论 53-54 第5章 结论、创新点与展望 54-55 5.1 结论 54 5.2 创新点 54 5.3 展望 54-55 参考文献 55-61 致谢 61
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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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