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2,4-二氯苯酚致草鱼原代肝脏细胞凋亡及其作用机理研究

作 者: 李慧
导 师: 张迎梅
学 校: 兰州大学
专 业: 动物学
关键词: 2,4-二氯苯酚(2,4-DCP) 草鱼 原代肝细胞 细胞凋亡 B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2) Bcl-2相关X蛋白(Bax) 活性氧(ROS) 肿瘤坏死因子(TNF-α) 凋亡抑制蛋白(IAP)
分类号: S941.91
类 型: 博士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


氯酚类化合物常被用作木材防腐剂、杀菌剂、农药和除草剂等,由于其难以降解,在环境中特别是水体中能稳定存在,不仅影响水生生物的生长和繁殖,还可以通过食物链进入人体,危害人体健康,是一类主要的环境污染物。2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)作为氯酚类化合物的一种,主要用于除草醚、2,4-滴以及药物硫双二氯酚的合成,由于其大量用于工农业并被释放到环境中,对生物产生毒性影响,美国和中国等许多国家都已将2,4-DCP列入了优先控制污染物的名单。2,4-DCP不仅能影响生物体的生长、发育和生殖,还可以在细胞和分子水平导致氧化应激、促使自由基的产生,影响相关基因的表达,甚至引起细胞死亡。细胞凋亡是指程序性的细胞死亡,可由线粒体信号或死亡受体等介导发生。已有研究证明2,4-DCP可以诱导细胞凋亡,但其诱导细胞凋亡的信号途径和分子机制尚不清楚。本实验以草鱼原代肝细胞为材料,通过测定2,4-DCP染毒后细胞的活力、细胞凋亡和线粒体膜电位,检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量及凋亡相关因子caspase-3、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein, Bax)、Bcl-2、TNF-α和IAP的mRNA表达情况,探讨了2,4-DCP诱导细胞凋亡的信号途径;通过加入外源性线粒体保护剂乙酰左旋肉碱盐酸(Acetyl-L-carnitine hydrochloride, ALC)进一步验证了线粒体信号途径在2,4-DCP诱导细胞凋亡过程中的作用,最终揭示了2,4-DCP诱导细胞凋亡的具体途径及分子机制,为2,4-DCP毒性作用机理的研究提供一定的科学依据。本论文具体研究结果如下:1.2,4-DCP暴露可以抑制草鱼原代肝细胞的细胞活力。本实验使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)检测2,4-DCP对草鱼原代肝细胞细胞活力的影响,结果显示:与对照组相比,2,4-DCP (0.50、1.00mM)暴露12h可以引起草鱼原代肝细胞细胞活力的显著降低(P<0.05)。2.2,4-DCP暴露可以诱导草鱼肝细胞的凋亡。使用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测2,4-DCP对草鱼原代肝细胞细胞凋亡的影响,与对照组相比,2,4-DCP (0.10、0.50mM)暴露12h显著增加了草鱼原代肝细胞的凋亡率(P<0.05)。3.2,4-DCP暴露可以引起草鱼肝细胞线粒体膜电位的降低。使用荧光分光光度计检测2,4-DCP对草鱼原代肝细胞线粒体膜电位的影响,检测到与对照组相比,2,4-DCP (0.10、0.50mM)暴露12h可以显著降低草鱼原代肝细胞的线粒体膜电位(P<0.05)。4.2,4-DCP暴露可以导致草鱼肝细胞的ROS的产生。使用流式细胞仪检测细胞内ROS爆发的时间点和ROS水平的变化,与对照组相比,2,4-DCP (0.10、0.50mM)暴露12h没有引起ROS的显著升高(P>0.05),但暴露5h可以引起细胞内ROS的显著升高(P<0.05)。5.2,4-DCP暴露可以诱导草鱼肝细胞凋亡相关基因的改变。使用实时定量PCR (qPCR)检测2,4-DCP对凋亡相关基因mRNA表达量的影响,与对照组相比,2,4-DCP可以导致caspase-3、TNF-α和Bax mRNA的表达量以及Bax/Bcl-2mRNA比值的升高(P<0.05)。6.ALC (5mM)抑制了2,4-DCP导致的草鱼肝细胞的凋亡,并显著恢复了线粒体膜电位(P<0.05),降低了caspase-3、TNF-α和Bax mRNA的表达量(P<0.05)以及Bax/Bcl-2mRNA的比值(P<0.05)。7.2,4-DCP暴露引起草鱼肝细胞IAP mRNA表达量的下降,但对草鱼IAP蛋白的表达没有影响。研究结果显示2,4-DCP导致草鱼肝细胞IAP mRNA表达量的变化。我们进一步利用生物信息学技术手段设计IAP基因的特异性引物,扩增IAP基因片段,运用原核表达系统表达抗原,免疫新西兰大白兔,获得抗血清后,通过亲和纯化得到IAP蛋白特异性的抗体并使用免疫印迹检测了2,4-DCP诱导的草鱼肝细胞中IAP蛋白的表达。然而,与对照组相比,2,4-DCP (0.10、0.50mM)对草鱼肝细胞LAP蛋白的表达没有明显影响(P>0.05)。以上结果表明:2,4-DCP诱导的草鱼肝细胞的凋亡是通过线粒体信号途径介导的。2,4-DCP染毒细胞后通过产生ROS引起氧化应激,降低线粒体膜电位,改变caspase-3和Bax mRNA的表达以及Bax/Bcl-2比值,最终导致细胞凋亡。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章 前言  11-29
  1.1 氯酚  11-14
    1.1.1 氯酚的基本性质  11
    1.1.2 氯酚的生物富集  11-12
    1.1.3 氯酚的代谢  12-13
    1.1.4 氯酸对动物体的损伤  13-14
    1.1.5 氯酚对人体的损伤  14
  1.2 2,4-二氯苯酚  14-17
    1.2.1 2,4-二氯苯酚的基本信息  15-16
    1.2.2 2,4-二氯苯酚的危害  16-17
  1.3 草鱼  17-18
  1.4 细胞凋亡  18-22
    1.4.1 细胞凋亡的简介  18-19
    1.4.2 线粒体途径介导的细胞凋亡  19-21
    1.4.3 死亡受体途径介导的细胞凋亡  21
    1.4.4 穿孔素/颗粒酶途径  21-22
  1.5 细胞凋亡常用的检测方法  22-25
    1.5.1 细胞形态学的改变  22-23
    1.5.2 DNA的降解  23
    1.5.3 对caspases及底物、调节因子、抑制因子的检测  23-24
    1.5.4 细胞膜的改变  24
    1.5.5 对包埋标本的凋亡检测  24
    1.5.6 与线粒体有关的检测  24-25
  1.6 凋亡抑制蛋白  25-26
  1.7 活性氧  26-27
  1.8 研究目的和意义  27-29
第二章 实验材料和方法  29-46
  2.1 实验材料  29
  2.2 主要试剂  29-30
  2.3 主要仪器设备  30-31
  2.4 主要溶液配制  31-32
  2.5 实验技术路线  32-33
  2.6 实验方法  33-40
    2.6.1 草鱼原代肝脏细胞的分离  33-34
    2.6.2. 细胞活力实验(MTT法)  34
    2.6.3 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡  34-35
    2.6.4 AV/PI双染检测细胞凋亡  35
    2.6.5 线粒体膜电位的检测  35-36
    2.6.6 活性氧的检测  36
    2.6.7 凋亡相关基因mRNA表达的影响  36-40
  2.7 草鱼细胞内凋亡抑制蛋白多克隆抗体的制备和检测  40-42
    2.7.1 引物设计及扩增片段的选择  40
    2.7.2 草鱼肝脏总RNA提取  40-41
    2.7.3 RT-PCR及IAP片段的克隆  41
    2.7.4 重组表达载体的构建  41
    2.7.5 IAP融合蛋白的诱导与表达  41
    2.7.6 IAP融合蛋白的纯化与定量  41-42
    2.7.7 多克隆抗血清的制备及纯化  42
    2.7.8 免疫印迹  42
  2.8 IAP蛋白表达的影响  42-45
    2.8.1 蛋白的提取  42-43
    2.8.2 蛋白浓度的测定  43
    2.8.3 蛋白的变性  43
    2.8.4 免疫印迹  43-45
  2.9 数据分析与作图  45-46
第三章 实验结果  46-57
  3.1 2,4-DCP对草鱼原代肝细胞细胞活力的影响  46
  3.2 2,4-DCP对草鱼原代肝细胞凋亡的影响  46-48
    3.2.1 细胞凋亡的形态学检测  46-47
    3.2.2 细胞凋亡率的检测  47-48
  3.3 2,4-DCP对线粒体膜电位的影响  48-49
  3.4 2,4-DCP对凋亡相关基因的影响  49-50
  3.5 2,4-DCP对ROS的影响  50-51
  3.6 2,4-DCP对TNF-α mRAN表达的影响  51
  3.7 2,4-DCP对草鱼肝细胞IAP mRAN和蛋白表达的影响  51-57
    3.7.1 2,4-DCP对草鱼肝细胞IAP mRAN表达的影响  51-52
    3.7.2 IAP多克隆抗体的制备  52-55
    3.7.3 2,4-DCP对IAP的影响  55-57
第四章 讨论  57-62
  4.1 2,4-DCP导致草鱼肝脏细胞活力下降和细胞凋亡  57-58
  4.2 2,4-DCP导致草鱼肝脏细胞凋亡与线粒体有关  58-59
  4.3 2,4-DCP导致草鱼肝脏细胞凋亡由ROS介导  59-60
  4.4 2,4-DCP导致草鱼肝脏细胞凋亡与死亡受体途径相关  60-61
  4.5 2,4-DCP对草鱼肝脏细胞IAP的影响  61-62
第五章 结论  62-63
  5.1 主要结论  62
  5.2 研究展望  62-63
参考文献  63-74
缩略词表  74-75
在读期间研究成果  75-76
致谢  76

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学 > 中毒
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