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海参溶菌酶在毕赤酵母中的表达及生物活性研究

作 者: 谷跃峰
导 师: 丛丽娜
学 校: 大连工业大学
专 业: 生物化工
关键词: 海参溶菌酶 毕赤酵母 表达 纯化 理化特性 生物活性
分类号: S917.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


本论文旨在构建并筛选出具有抑菌活性的海参溶菌酶(Stichopus japonicusLysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌,并对表达产物进行纯化,研究了其理化特性生物活性。利用Trizol试剂法从海参肠组织中提取总RNA,根据本实验室已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No. EF036468)利用Primer Premier5.0软件设计引物,以总RNA为模板经一步法RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株,经甲醇诱导表达,上清液进行硫酸铵沉淀,透析后得到溶菌酶粗品。再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。利用浊度法测定该酶在不同pH和温度下的活性,以此来确定该酶的最适pH值、最适温度、pH稳定性及热稳定性。利用滤纸片液体扩散法测定重组海参溶菌酶的抑菌谱。重组质粒pPIC9K-SJL转化毕赤酵母GS115后经MD平板筛选出表型为His+的重组酵母菌株104株,然后经MD、MM平板确定其表型均为Muts,即甲醇利用缓慢型,最后由含4mg/mL抗生素G418的YPD平板筛选得到了31株高拷贝的溶菌酶基因工程菌,再经甲醇诱导表达筛选出7株具有抗菌活性的重组海参溶菌酶菌株。经硫酸铵沉淀法和CM52-纤维素阳离子交换柱纯化后,酶的比活力为26.9U/mg,总活力回收率为28.1%,纯化倍数为4.3倍。重组海参溶菌酶的最适pH为6.5,最适温度为35℃,在pH5.0~7.5范围内,50℃以下有较好的稳定性。抑菌谱测定结果显示重组海参溶菌酶对6种指示菌均表现出抑菌性,尤其对副溶血弧菌的抑制作用最强。结果表明SJL在毕赤酵母中得到成功表达,并通过离子交换层析得到了电泳纯的溶菌酶。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-12
第一章 文献综述  12-27
  1.1 溶菌酶简介  12-16
    1.1.1 溶菌酶的结构及理化性质  12-13
      1.1.1.1 溶菌酶的结构  12-13
      1.1.1.2 溶菌酶的理化性质  13
    1.1.2 溶菌酶的生物学功能  13-14
    1.1.3 溶菌酶的分类  14-16
      1.1.3.1 噬菌体溶菌酶  14
      1.1.3.2 微生物源溶菌酶  14-15
      1.1.3.3 植物源溶菌酶  15
      1.1.3.4 c 型溶菌酶  15-16
      1.1.3.5 g 型溶菌酶  16
      1.1.3.6 i 型溶菌酶  16
  1.2 溶菌酶的应用  16-21
    1.2.1 食品工业上的应用  16-18
      1.2.1.1 在乳制品中的应用  16-17
      1.2.1.2 水产类制品的保鲜和防腐  17
      1.2.1.3 酒及饮料防腐中的应用  17-18
      1.2.1.4 食品软包装中的应用  18
      1.2.1.5 保健功能性食品中的应用  18
    1.2.2 医学上的应用  18-19
      1.2.2.1 疾病治疗中的应用  18
      1.2.2.2 疾病诊断中的应用  18-19
    1.2.3 饲料工业上的应用  19-20
      1.2.3.1 优质新型的绿色保健饲料添加剂  19
      1.2.3.2 良好的饲料防腐杀菌剂  19
      1.2.3.3 改善肠道微生物群,提高抗病力  19-20
      1.2.3.4 防治仔猪腹泻  20
    1.2.4 生物工程上的应用  20
    1.2.5 水产养殖上的应用  20-21
  1.3 溶菌酶基因工程的研究进展  21-22
    1.3.1 以大肠杆菌为宿主  21
    1.3.2 以巴斯德毕赤酵母为宿主  21-22
    1.3.3 以霉菌为宿主  22
  1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统  22-24
    1.4.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点  22-23
    1.4.2 巴斯德毕赤酵母表达系统的组成及构建  23-24
      1.4.2.1 表达宿主菌  23
      1.4.2.2 表达载体  23-24
      1.4.2.3 转化及整合  24
  1.5 研究的主要内容、目的、意义和技术路线  24-27
    1.5.1 研究的主要内容  24-25
    1.5.2 研究目的和意义  25
    1.5.3 技术路线  25-27
      1.5.3.1 海参溶菌酶基因的克隆  25-26
      1.5.3.2 海参溶菌酶基因的毕赤酵母表达  26
      1.5.3.3 重组海参溶菌酶的纯化生物活性研究  26-27
第二章 材料与方法  27-47
  2.1 海参溶菌酶基因的克隆  27-33
    2.1.1 材料与仪器  27-29
      2.1.1.1 材料  27
      2.1.1.2 菌种与质粒  27
      2.1.1.3 主要试剂  27
      2.1.1.4 主要溶液  27-28
      2.1.1.5 主要仪器  28-29
      2.1.1.6 培养基  29
    2.1.2 方法与步骤  29-33
      2.1.2.1 引物的设计  29
      2.1.2.2 总 RNA 的提取  29-30
      2.1.2.3 RT-PCR  30-31
      2.1.2.4 PCR 产物的回收  31-32
      2.1.2.5 连接克隆载体及转化 DH5α  32
      2.1.2.6 转化子的鉴定  32-33
  2.2 海参溶菌酶重组毕赤酵母的构建与表达  33-44
    2.2.1 材料与仪器  33-38
      2.2.1.1 菌种与质粒  33
      2.2.1.2 酶与主要试剂  33
      2.2.1.3 主要溶液  33-36
      2.2.1.4 主要仪器设备  36-37
      2.2.1.5 培养基  37-38
    2.2.2 方法与步骤  38-44
      2.2.2.1 毕赤酵母感受态细胞的制备  38
      2.2.2.2 质粒 DNA 的回收  38-39
      2.2.2.3 重组表达载体的构建  39-40
      2.2.2.4 毕赤酵母的转化  40-41
      2.2.2.5 转化子的筛选  41
      2.2.2.6 转化子的鉴定  41-42
      2.2.2.7 重组海参溶菌酶的诱导表达  42
      2.2.2.8 表达产物的 SDS-PAGE 分析  42-44
  2.3 重组海参溶菌酶的纯化  44-45
    2.3.1 溶菌酶活性的测定方法  44
    2.3.2 蛋白质含量的测定方法  44
    2.3.3 硫酸铵分级沉淀  44-45
    2.3.4 阳离子交换层析  45
  2.4 重组海参溶菌酶的生物学研究  45-47
    2.4.1 溶菌酶活性的检测  45
    2.4.2 海参溶菌酶的酶学性质  45-46
      2.4.2.1 最适 pH 和温度  45-46
      2.4.2.2 pH 稳定性和热稳定性  46
    2.4.3 海参溶菌酶的抑菌谱的测定  46-47
第三章 结果与讨论  47-62
  3.1 SJL 基因的亚克隆  47-50
    3.1.1 SJL 基因的扩增  47-48
    3.1.2 克隆载体的转化  48-49
    3.1.3 阳性转化子的测序鉴定  49-50
  3.2 重组毕赤酵母的构建与表达  50-56
    3.2.1 双酶切重组克隆载体和表达载体  50
    3.2.2 重组表达载体的构建  50-52
    3.2.3 毕赤酵母的转化  52-53
    3.2.4 重组毕赤酵母的筛选  53-55
    3.2.5 SJL 的诱导表达  55-56
  3.3 重组海参溶菌酶的纯化  56-58
    3.3.1 蛋白质含量标准曲线  56
    3.3.2 rSJL 的纯化结果  56-58
  3.4 rSJL 的生物学研究  58-62
    3.4.1 rSJL 的最适 pH 和温度  58-59
    3.4.2 rSJL 的 pH 稳定性和热稳定性  59-60
    3.4.3 rSJL 的抑菌谱测定  60-62
第四章 结论  62-63
参考文献  63-67
附录 A  67-68
附录 B  68-69
致谢  69

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