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海洋生物共附生微生物的分离和抗菌活性鉴定

作 者: 李爱民
导 师: 丛丽娜
学 校: 大连工业大学
专 业: 生物化工
关键词: 16S rDNA序列分析 芽孢杆菌 抗菌活性 海洋有益菌
分类号: S917.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


在水产养殖业繁荣发展的今天,为防治水产病害的发生而滥用抗生素等药物会对环境及人类自身产生严重的危害,因此人们正积极寻找更为安全有效的水产养殖病害防治方法。因此,选择具有抑菌活性的细菌作为潜在的有益菌进行研究开发,具有重要的实践意义。本研究从大连海域生长的野生海参肠中分离筛选到一株细菌,命名为HS-A38。采用琼脂扩散法进行抑菌实验,发现菌株HS-A38具有较广泛的抗菌谱,尤其对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、溶壁微球菌、大肠杆菌和志贺菌显示出较强的抗菌作用。通过细菌形态观察,发现HS-A38菌株属于革兰氏阳性棒状杆菌,菌落呈乳白色、表面光滑。而常规生理生化测试表明,该菌株与芽孢杆菌属细菌的特征非常相似。为了进一步确定菌株HS-A38的分类学地位,测定了其16S rRNA基因序列(GQ466597),与相关细菌种属相应序列的同源性进行比较,并构建了分子系统发育树。结果显示,菌株HS-A38与6个枯草芽孢杆菌和3个解淀粉芽孢杆菌的亲缘关系最近,相似性达100%。综合上述结果,菌株HS-A38可初步鉴定为枯草芽孢杆菌。本研究对HS-A38菌株的发酵条件做了初步探索,结果表明该菌株的适宜培养条件为温度30℃,初始pH值范围为7~8,在500mL三角摇瓶中的装液量为50mL,最佳培养时间40h。在此培养条件下,菌株HS-A38的活菌数能达到3.01×10~9CFU/mL,说明该菌株可以作为潜在的海洋有益菌应用于水产养殖中。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-11
第一章 文献综述  11-29
  1.1 引言  11-12
  1.2 芽孢杆菌属  12-14
    1.2.1 芽孢杆菌属的主要特征  12-13
    1.2.2 芽孢杆菌抗菌物质的简介  13-14
  1.3 细菌素的简介  14-25
    1.3.1 细菌素的定义  14-15
    1.3.2 细菌素与抗生素的区别  15-16
    1.3.3 细菌素的分类  16-17
    1.3.4 细菌素的理化特性  17-21
      1.3.4.1 细菌素对蛋白酶的敏感性  17
      1.3.4.2 细菌素的热稳定性  17
      1.3.4.3 细菌素的抑菌谱  17-18
      1.3.4.4 细菌素的作用方式  18
      1.3.4.5 细菌素的生物合成  18-21
      1.3.4.6 抗菌活性测定方法  21
    1.3.5 细菌素的应用  21-25
      1.3.5.1 细菌素在肉类制品中的应用  21-22
      1.3.5.2 细菌素在乳制品中的应用  22
      1.3.5.3 细菌素在在酒品中的应用  22-23
      1.3.5.4 细菌素在蔬菜制品中的应用  23
      1.3.5.5 细菌素在食品包装纸和塑料薄膜方面的应用  23
      1.3.5.6 细菌素在饲料中的应用  23-25
  1.4 芽孢杆菌细菌素的研究现状  25-28
    1.4.1 芽孢杆菌制剂在饲料添加剂的应用  25-26
    1.4.2 芽孢杆菌细菌素的其他应用  26-28
  1.5 本研究的内容和意义  28-29
    1.5.1 主要研究内容  28
    1.5.2 论文研究的意义  28-29
第二章 抑菌活性海洋微生物的分离与筛选  29-38
  2.1 引言  29
  2.2 材料  29-31
    2.2.1 仪器  29
    2.2.2 试剂及辅助器材  29-30
    2.2.3 培养基  30
      2.2.3.1 海洋微生物分离培养基  30
      2.2.3.2 海洋微生物发酵培养基  30
      2.2.3.3 指示细菌培养基  30
    2.2.4 人工海水  30-31
    2.2.5 指示菌  31
  2.3 方法  31-33
    2.3.1 样品采集  31
    2.3.2 菌株的分离  31
    2.3.3 拮抗菌株的筛选  31-33
      2.3.3.1 指示菌菌悬液的配制  31-32
      2.3.3.2 抑菌活性检测平板的制作  32
      2.3.3.3 滤纸片法初筛  32
      2.3.3.4 牛津杯法复筛  32
      2.3.3.5 有机酸作用的排除  32-33
      2.3.3.6 过氧化氢的检测  33
    2.3.4 抗菌谱分析  33
  2.4 结果和分析  33-36
    2.4.1 海洋微生物的分离  33
    2.4.2 拮抗菌株的筛选  33-36
      2.4.2.1 初筛  33-35
      2.4.2.2 复筛  35
      2.4.2.3 有机酸作用的排除  35-36
      2.4.2.4 过氧化氢作用的排除  36
    2.4.3 抗菌谱分析  36
  2.5 本章小结  36-38
第三章 海洋细菌 HS-A38 的鉴定  38-46
  3.1 试验仪器  38
  3.2 材料  38-40
    3.2.1 菌种  38
    3.2.2 药品  38-39
    3.2.3 培养基  39
      3.2.3.1 生物学特性培养基  39
      3.2.3.2 生理生化鉴定培养基  39
    3.2.4 试剂  39-40
      3.2.4.1 生理生化实验用试剂  39-40
      3.2.4.2 DNA 提取主要试剂  40
  3.3 方法  40-42
    3.3.1 菌落培养特征  40
      3.3.1.1 菌株形态特征的观察  40
      3.3.1.2 革兰氏染色  40
      3.3.1.3 芽孢染色  40
    3.3.2 生理生化特征  40-42
      3.3.2.1 触酶试验(过氧化氢酶测定)  40-41
      3.3.2.2 运动型  41
      3.3.2.3 甲基红/V.P 试验  41
      3.3.2.4 淀粉水解试验  41
      3.3.2.5 硝酸盐还原试验  41
      3.3.2.6 耐盐性试验  41
      3.3.2.7 明胶液化试验  41-42
    3.3.3 HS-A38 菌的 16S rDNAPCR 扩增和序列测定  42
  3.4 结果与分析  42-45
    3.4.1 菌落形态特征  42-43
    3.4.2 菌体形态特征  43
    3.4.3 生理生化特征  43
    3.4.4 16S rDNA 序列分析  43-45
  3.5 本章小结  45-46
第四章 海洋细菌 HS-A38 发酵条件的研究  46-57
  4.1 材料  46
    4.1.1 菌种  46
    4.1.2 培养基  46
  4.2 方法  46-50
    4.2.1 培养基组分优化  46-49
      4.2.1.1 碳源对菌体生长以及抗菌活性物质的影响  46-47
      4.2.1.2 氮源对菌体生长以及产抗菌活性物质的影响  47
      4.2.1.3 不同营养物质对菌体生长以及产抗菌活性物质的影响  47-48
      4.2.1.4 牛肉膏浓度对菌体生长以及产抗菌活性物质的影响  48
      4.2.1.5 金属离子对菌体生长以及产抗菌活性物质的影响  48-49
    4.2.2 最适培养条件测定  49-50
      4.2.2.1 初始 pH 对 HS-A38 菌株生长及抑菌活性影响的测定  49
      4.2.2.2 培养温度对 HS-A38 菌株生长及抑菌活性影响的测定  49
      4.2.2.3 NaCl 浓度对 HS-A38 菌生长及其抑菌活性的影响  49
      4.2.2.4 通气量对 HS-A38 菌生长及其抑菌活性的影响  49
      4.2.2.5 不同发酵时间对 HS-A38 菌株生长量的影响  49-50
  4.3 结果与分析  50-56
    4.3.1 培养基组分优化  50-53
      4.3.1.1 碳源对菌体生长和产抗菌活性物质的影响  50
      4.3.1.2 氮源对菌体生长和产抗菌活性物质的影响  50-51
      4.3.1.3 不同营养物质对菌体生长以及产抗菌活性物质的影响  51
      4.3.1.4 牛肉膏浓度对菌体生长和产抗菌活性物质的影响  51-52
      4.3.1.5 金属离子对菌体生长和产抗菌活性物质的影响  52-53
    4.3.2 最适培养条件测定  53-56
      4.3.2.1 起始 pH 对 HS-A38 菌株的生长及抑菌活性的影响  53
      4.3.2.2 培养温度对 HS-A38 菌株生长及抑菌活性的影响  53-54
      4.3.2.3 NaCl 浓度对 HS-A38 菌株生长及抑菌活性的影响  54-55
      4.3.2.4 通气量对 HS-A38 菌株的生长及抑菌活性的影响  55
      4.3.2.5 不同的发酵时间对 HS-A38 菌株生长量的影响  55-56
  4.4 本章小结  56-57
第五章 海洋细菌 HS-A38 胞外拮抗物质的研究  57-61
  5.1 引言  57
  5.2 材料  57
    5.2.1 菌株  57
    5.2.2 培养基  57
  5.3 方法  57-59
    5.3.1 无菌上清液的制备  57-58
    5.3.2 硫酸铵盐析法提取细菌素  58
    5.3.3 细菌素活性的测定方法  58-59
      5.3.3.1 温度对细菌素稳定性测定  58
      5.3.3.2 pH 对细菌素稳定性测定  58
      5.3.3.3 蛋白酶对细菌素稳定性测定  58-59
  5.4 结果和分析  59-60
    5.4.1 细菌素的硫酸铵分级沉淀  59
    5.4.2 温度对细菌素活性影响  59-60
    5.4.3 pH 对细菌素活性的影响  60
    5.4.4 细菌素对蛋白酶的敏感性  60
  5.5 本章小结  60-61
结论  61-62
参考文献  62-66
致谢  66

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