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日本七鳃鳗Btk的原核表达、抗体制备及相关免疫学研究

作 者: 赵静
导 师: 李庆伟
学 校: 辽宁师范大学
专 业: 海洋生物学
关键词: Btk 日本七鳃鳗 信号转导 系统发育 免疫进化
分类号: S917.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


Btk是一种胞内非受体酪氨酸激酶。它在高等脊椎动物B淋巴细胞的发育,分化和信号转导中扮演重要的角色。Btk既参与适应性免疫,同时也参与先天免疫防御作用。先天免疫应答是机体抵御入侵微生物的第一道防线。树突细胞,中性粒细胞和巨噬细胞这些吞噬细胞是参与先天免疫的主要成员。在适应性免疫中,Btk最关键的作用就是在B细胞受体信号通路中发挥的作用,这条通路也是目前为止研究得最多的通路。Btk最初发挥其适应性免疫的功能是在什么物种中呢?目前已经在软骨鱼类鳐中发现BTK的同源物,并证明其参与B淋巴细胞的发育。近些年的研究表明,适应性免疫的起源可以追溯到无颌类脊椎动物七鳃鳗,对无颌类脊椎动物的研究将为适应性免疫的起源奠定坚实的理论基础。本实验前期工作已经证明在无颌类脊椎动物日本七鳃鳗中有Btk分子的存在。那么这种在B细胞信号转导中起关键作用的分子Btk在日本七鳃鳗中是发挥着怎样的功能呢?这是研究七鳃鳗适应性免疫的一个突破口。本篇论文根据已知的日本七鳃鳗BTK的cDNA全长序列,选取其中十分保守的激酶结构域,表达出重组蛋白,制备兔抗日本七鳃鳗Btk重组蛋白的多克隆抗体,对多克隆抗体进行纯化,并利用纯化的多克隆抗体对Btk进行相关的免疫学研究。Real-time PCR显示,BTK mRNA在日本七鳃鳗免疫相关的组织中表达量较高。利用LPS刺激日本七鳃鳗,其白细胞中BTK的mRNA水平显著上升。流式细胞术和Western blot结果显示,Btk分子主要表达于日本七鳃鳗的白细胞中,并且经过LPS刺激后白细胞中Btk的表达水平显著上调,这进一步证明了日本七鳃鳗Btk可能发挥免疫相关的作用。同时,FACS结果也显示VLRB和Btk共表达于同一白细胞类群中。七鳃鳗的免疫信号转导是由可变淋巴受体(VLR)介导的。因此推测,Btk很有可能参与由VLR介导的信号转导。这些数据为今后研究适应性免疫的起源与进化方面提供一定的参考。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
1 绪论  8-17
  1.1 Btk的结构  8
  1.2 Btk与其它物种序列的相似性  8-9
  1.3 Btk在适应性免疫中主要参与B细胞信号通路  9-14
    1.3.1 B细胞受体激活Btk的机制  11
    1.3.2 Btk活性的抑制  11-12
    1.3.3 Btk活化的下游分子  12-13
    1.3.4 Btk活化的多样性  13-14
  1.4 Btk与先天性免疫的关系  14-15
    1.4.1 Btk在巨噬细胞中的作用  14
    1.4.2 Btk在肥大细胞中的作用  14-15
    1.4.3 Btk在树突细胞中的功能  15
  1.5 Btk与Toll样受体  15
  1.6 BTK突变与X连锁的丙种球蛋白缺乏症(XLA)  15-16
  1.7 意义  16-17
2 日本七鳃鳗Btk分子的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备  17-36
  2.1 日本七鳃鳗Btk的原核表达及重组蛋白纯化  17-27
    2.1.1 材料  17
    2.1.2 方法  17-25
    2.1.3 结果  25-27
  2.2 兔抗日本七鳃鳗Btk多克隆抗体的制备及鉴定  27-34
    2.2.1 材料  27-28
    2.2.2 方法  28-31
    2.2.3 结果  31-34
  2.3 讨论  34
  2.4 小结  34-36
3 日本七鳃鳗BTK Real-time PCR分析  36-42
  3.1 材料  36-37
    3.1.1 主要试剂  36
    3.1.2 主要仪器  36-37
  3.2 方法  37-39
    3.2.1 日本七鳃鳗刺激方案  37
    3.2.2 日本七鳃鳗白细胞及其组织的分离  37
    3.2.3 日本七鳃鳗白细胞总RNA及各组织总RNA的提取  37-38
    3.2.4 RNA质量检测  38
    3.2.5 Real-time PCR法检测BTK mRNA的相对表达量  38-39
    3.2.6 统计学分析  39
  3.3 结果  39-40
  3.4 讨论  40-41
  3.5 小结  41-42
4 Btk蛋白的Western blot及流式细胞分析(FACS)  42-48
  4.1 Western blot分析Btk蛋白的表达  42-43
    4.1.1 材料  42
    4.1.2 方法  42
    4.1.3 结果  42-43
  4.2 流式细胞分析Btk在白细胞中的表达  43-46
    4.2.1 材料  43-44
    4.2.2 方法  44
    4.2.3 结果  44-46
  4.3 讨论  46-47
  4.4 小结  47-48
结论  48-49
本论文的创新点  49-50
参考文献  50-54
附录A 日本七鳃鳗Btk蛋白的C端激酶结构域的编码区  54-55
附录B Real-time PCR中管家基因GAPDH和目的基因BTK的标准曲线  55-56
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  56-57
致谢  57

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