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中国卤虫CIC基因在早期胚胎发育及盐胁迫过程中的表达模式

作 者: 张巧智
导 师: 侯林
学 校: 辽宁师范大学
专 业: 海洋生物学
关键词: As-CIC GCK-3/ste20 卤虫 盐度胁迫 胚胎发育
分类号: S917.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


卤虫(Artemia sinica)广泛分布在沿海盐田及内陆高盐水体中,卤虫的生活环境经常是随季节性盐度变化而变化的。因此,适应高渗和低渗环境在卤虫生理学方面则显得十分的重要。中国卤虫的氯离子通道蛋白基因(As-CIC),是氯离子通道蛋白家族的一个成员,当细胞处于高渗或者低渗环境时,细胞通过激活钾离子通道和氯离子通道来介导离子的内流或者外流从而导致水的流动来调剂细胞的体积使其维持细胞内外离子的平衡。另外在C1C渗透调节通路中GCK-3/ste20(ste20)基因也发挥着必不可或缺的作用,GCK-3/Ste20是一个丝氨酸/苏氨酸激酶超级家族成员之一,在酵母菌中,细胞分裂、生长、周期的调控以及在不同渗透胁迫下维持细胞内外离子的动态平衡都是通过激活Ste20从而引发一个MAPK的级联反应完成的。本文以中国卤虫为实验材料,首次采用分子克隆技术(RACE)成功克隆并得到C1C基因2201bp的全长序列。被预测为跨膜11次,在C末端具有β胱硫醚合酶结构域和电压门控C1C结构域。利用原位杂交技术对C1C在卤虫胚胎发育不同时期的表达部位进行了研究,结果显示As-CIC的表达位置广泛且平均,整个虫体均有分布,呈组成性表达。通过实时荧光定量PCR技术对C1C在卤虫胚胎发育不同时期及对As-CIC和GCK-3/ste20基因在盐度胁迫实验中的表达量进行研究,结果表明As-CIC在胚胎发育各时期均有表达,在进入下一个生长期以及生存环境发生变化时即15h和40h呈现出很高的表达水平,进入成虫期后表达量仍然维持在一个很高的水平。在不同盐度胁迫过程中,As-CIC和GCK-3/ste20基因总体上呈下调趋势。C1C随着盐度的增加呈上升趋势,除了盐度为200‰其余实验组的表达量明显低于对照组(28‰)而GCK-3/ste20则随着盐度的增加表达量呈下降的趋势。随着发育的进行,这表明,盐度胁迫基因As-CIC在卤虫早期胚胎发育过程中可能参与细胞体积调节和渗透调节。因此了解抗逆耐盐基因,对我们以后治理盐碱化可能具有一定的理论意义,同时对抗灾减灾和耐盐动、植物的基因改良具有实际应用价值。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-9
1. 前言  9-20
  1.1 卤虫的形态特征、地理分布及发育过程  9-12
    1.1.1 卤虫的分类学地位和地理分布  9-10
    1.1.2 卤虫形态学特征及细胞生物学特征  10-11
    1.1.3 卤虫胚胎发育及休眠卵  11
    1.1.4 卤虫的经济价值  11-12
  1.2 ClC基因的结构、功能及盐度胁迫下的调控机制  12-17
    1.2.1 渗透调节  12-14
    1.2.2 氯离子通道的分类  14-16
    1.2.3 ClC的结构和功能  16-17
  1.3 GCK-3/Ste20的结构和功能  17
  1.4 ClC和GCK-3/Ste20的调控关系  17-19
    1.4.1 Ste20激酶调控Na-K-2Cl(NKCC)和K-Cl(KCC)共转运体  17-18
    1.4.2 Ste20调控ClC离子通道  18-19
  1.5 本研究的目的和意义  19-20
2. 材料与方法  20-35
  2.1 材料  20-24
    2.1.1 卤虫的孵化及培养条件  20
    2.1.2 主要试剂  20-24
    2.1.3 仪器与设备  24
  2.2 方法  24-34
    2.2.1 卤虫总RNA的提取  24-25
    2.2.2 反转录合成cDNA  25-26
    2.2.3 ClC基因片段的获得  26-27
    2.2.4 目的片段的纯化  27
    2.2.5 目的片段的克隆及测序  27-29
    2.2.6 RACE技术获得ClC全长序列  29-30
    2.2.7 原位杂交  30-33
    2.2.8 实时荧光定量PCR  33-34
    2.2.9 生物信息学分析  34
  2.3 Real-timePCR的生物学统计  34-35
3. 结果  35-51
  3.1 RNA提取质量  35
  3.2 ClC基因片段  35-36
  3.3 ClC的全长序列  36-41
  3.4 ClC的进化分析  41-42
  3.5 As-ClC在卤虫不同发育时期的表达  42-51
    3.5.1 As-ClC基因的表达部位  42-43
    3.5.2 As-ClC基因的表达模式  43-51
4. 讨论  51-54
  4.1 中国卤虫ClC基因的全长序列分析  51
  4.2 中国卤虫ClC基因的表达部位及表达模式  51-52
  4.3 中国卤虫As-ClC和GCK-3/ste20基因在盐度胁迫下的相互作用  52-53
  4.4 实验条件的优化  53-54
参考文献  54-59
致谢  59

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