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中国卤虫一氧化氮合成酶基因的克隆及表达模式研究

作　者: 杜滨
导　师: 侯林
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 中国卤虫一氧化氮合成酶 NOS 先天免疫 Realtime
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

卤虫(Artemia)俗称盐水丰年虫或丰年虾,隶属于甲壳纲,鳃足亚纲,无甲目,卤虫科,卤虫属,是一类比较低级的无脊椎动物,因此其免疫系统只有先天性免疫,缺少高等动物的T细胞及B细胞等专一的特异的免疫系统。卤虫的先天免疫系统主要是细胞防御和体液防御机制,当受到外界病原侵害的时候会启动一系列防御体制来消灭病原体。NOS在两种形式的免疫中均起到了不可忽视的作用。一氧化氮信号通路在脊椎动物和无脊椎动物中均参与体内多种生理过程,它作为唯一的气体第二信使,在细胞间传递维持正常生理活动或某些应激反应,其在体内的直接限速酶为一氧化氮合成酶(NOS)。在甲壳类动物中,NOS在神经系统的稳定和先天免疫中起到了关键的作用。它的三种同工酶：神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)在维持神经的正常生理活动、维持内皮细胞的正常舒张及抵御外界病毒细菌侵害等方面各自发挥着不同的功效。这三种同工酶高度保守,具有相同的结构域,分子量上略有区别,nNOS和eNOS为钙依赖性,iNOS则不依赖钙,无需结合钙调蛋白,就能在免疫防御中发挥作用。本实验通过RT-PCR和RACE技术克隆出了中国卤虫NOS(AsNOS)全序列,共1488bp,开放阅读框1332bp,编码了443个氨基酸,约50.7kDa。AsNOS与斑节对虾(Penaeus monodon)的NOS同源性最高,达到88%,AsNOS序列中包含NADPH结合结构域和FAD结合结构域。运用Realtime技术对AsNOS的表达模式进行了初步的研究,分别测量了不同时期、不同菌刺激、不同温度胁迫、不同盐度胁迫培养下AsNOS表达量的变化,由分析的数据作图可直观的看到0h的AsNOS表达量最高,之后表达量持续降低,40h时值降到最低,然后回升至一个稳定的数值并持续表达。不同盐度胁迫时AsNOS表达量呈下调,但各浓度下表达量相差不大,说明AsNOS与抵御高盐环境无直接关系。革兰氏阳性菌刺激卤虫24h后,体内NOS下调表达,但随着菌液浓度的提高有上升表达的趋势；革兰氏阴性菌刺激后,AsNOS总体呈下调,随着菌液浓度提高表达量有下降趋势。在不同温度的胁迫下,AsNOS表达量升高,在14℃时达到最高值,温度低于14℃后表达量随着温度降低而降低。由此可见NOS在卤虫体内参与重要的生理活动,对卤虫免疫防御及抗逆具有重要的意义。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
缩略语表  8-9
1. 前言  9-20
  1.1 一氧化氮合成酶(NOS)的研究进展  9-14
    1.1.1 NO的生物特性与生理作用  9-10
    1.1.2 NOS的结构与功能  10-14
    1.1.3 研究目的与意义  14
  1.2 卤虫的分类及分布、生物学特征及经济学价值  14-20
    1.2.1 卤虫的生物学特征  14-15
    1.2.2 卤虫的分类及分布  15-16
    1.2.3 卤虫的胚胎发育及生活史  16-17
    1.2.4 卤虫的免疫防御系统  17-19
    1.2.5 卤虫的经济价值  19-20
2 材料与方法  20-33
  2.1 材料  20-22
    2.1.1 卤虫孵化及培育条件  20
    2.1.2 实验主要药品  20-22
    2.1.3 实验仪器设备  22
  2.2 实验操作流程  22-33
    2.2.1 总RNA提取  22-23
    2.2.2 反转录  23
    2.2.3 获得AsNOS基因的EST  23-24
    2.2.4 3’RACE技术扩增序列  24-28
    2.2.5 5’RACE技术扩增基因全长  28-29
    2.2.6 卤虫NOS基因的表达模式研究  29-31
    2.2.7 生物信息学分析  31-33
3. 结果  33-49
  3.1 AsNOS基因全序列  33-40
    3.1.1 总RNA提取  33
    3.1.2 AsNOS基因片段扩增  33-34
    3.1.3 AsNOS基因全长的扩增  34-40
  3.2 AsNOS生物信息学分析  40-44
    3.2.1 蛋白质基本理化性质  40
    3.2.2 二级结构  40-43
    3.2.3 三级空间结构  43-44
  3.3 AsNOS表达模式研究  44-49
4 讨论  49-54
  4.1 AsNOS全序列分析  49-50
  4.2 AsNOS基因功能初步分析  50-52
    4.2.1 不同发育时期  50-51
    4.2.2 革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌  51
    4.2.3 不同温度  51-52
    4.2.4 不同盐度  52
  4.3 实验条件优化  52-54
参考文献  54-57
致谢  57

中国卤虫一氧化氮合成酶基因的克隆及表达模式研究

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