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虾夷扇贝大防御素基因的克隆、表达及G-型溶菌酶基因的启动子分析
作 者: 于赫男
导 师: 赫崇波
学 校: 辽宁师范大学
专 业: 海洋生物学
关键词: 虾夷扇贝 大防御素 基因表达 G-型溶菌酶 启动子分析
分类号: S917.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)是在大连沿海的主要增养殖贝类。但是,随着养殖规模的不断扩大以及养殖环境的变化,虾夷扇贝养殖出现了严重的病害和死亡现象,因此,研究和探索虾夷扇贝死亡的原因及其防治十分必要。本研究是以两种重要的免疫相关基因—大防御素和G型溶菌酶基因作为研究对象,通过分子生物学手段,克隆分析大防御素基因,通过菌刺激实验,利用实时定量方法了解该基因的表达调控规律;通过获得G型溶菌酶基因的启动子序列,并对其进行分析,了解其转录表达调控机制。本研究采用基因克隆的方法,从虾夷扇贝外套膜cDNA文库中克隆得到虾夷扇贝大防御素(MyBD)全长cDNA序列(基因登录号:GH736001)。 MyBD的cDNA全长为720bp,通过生物学软件分析cDNA结构,5’非编码区(UTR)为29bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)384bp,编码127个氨基酸残基,3’UTR长度为307bp,包含一个公认的多腺苷酸化信号序列AATAAA和一个poly(A)尾巴。预测得到的MyBD氨基酸序列具有大防御素的一般特征,包括二硫键和功能结构域,这说明MyBD是大防御素家族的一员。利用QRT-PCR(quantitative real time PCR)分析MyBD mRNA在不同组织中的表达,以及鳗弧杆菌(Vibrillo anguillarum)感染后在虾夷扇贝血淋巴中各时间段的相对表达量。实验发现MyBD在成体扇贝的外套膜组织中表达量最高,菌刺激36小时后实验组与对照组的表达量差异达到最大。因此推论可知,MyBD可能是虾夷扇贝中一种重要的免疫相关基因,在虾夷扇贝的成体组织中起着重要作用。为分析基因结构,通过扩增测序得到了3段内含子序列,编码区两段内含子长度分别为2664bp,2176bp,内含子两侧都具有RNA正确剪接所必需的识别位点(GT/AG),另一段内含子通过基因步移得到,位于5’UTR,长度尚未确定,这3段内含子将已知序列分成4部分。溶菌酶是免疫系统中的重要免疫效应物之一,能通过水解细菌细胞壁杀死细菌。根据虾夷扇贝G型溶菌酶基因的已知序列设计引物,通过基因步移的方法扩增出MyLysoG的5’端侧翼序列,测序所得长度为978bp。 TRANSFAC软件对MyLysoG的5’端侧翼序列进行分析发现,该基因的启动子区除了具有TATA box外,还具备Oct-1、S8、C/EBP、 CdxA等与免疫基因激活的转录因子潜在的结合位点。通过比对15个扇贝的MyLysoG启动子序列发现了9个SNP位点和3个得失位点,这些突变位点具有遗传连锁性,可区分为两种单倍型,两种单倍型中的转录因子结合位点也因突变位点的差异而不同。目前,这种单倍型现象还未在其他扇贝的启动子中发现。这种单倍型标记可以帮助分析G型溶菌酶基因在不同扇贝中的表达水平,进而可以把它当成今后分析扇贝抗病性的潜在标记,这一发现对今后研究扇贝的免疫系统具有重要意义。
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全文目录
摘要 4-5 Abstract 5-9 1. 引言 9-16 1.1 虾夷扇贝增养殖及其存在的问题 9-10 1.1.1 虾夷扇贝的增养殖 9 1.1.2 虾夷扇贝的现存问题 9-10 1.2 无脊椎动物的先天性免疫 10-11 1.3 防御素 11-13 1.3.1 防御素与抗菌肽的关系 11 1.3.2 抗菌肽与防御素的作用机理 11-12 1.3.3 防御素的种类及分布 12-13 1.4 溶菌酶 13-15 1.5 本研究的目的和意义 15-16 1.5.1 本研究的目的 15 1.5.2 本研究的意义 15-16 2. 虾夷扇贝大防御素基因的克隆与表达研究 16-32 2.1 前言 16-17 2.2 实验材料与方法 17-22 2.2.1 实验材料 17 2.2.2 实验方法 17-22 2.2.2.1 MyBD基因序列的获得 17-18 2.2.2.2 MyBD基因序列的生物信息学分析 18-19 2.2.2.3 RNA的提取 19-20 2.2.2.4 反转录 20 2.2.2.5 Real-time PCR检测MyBD的组织分布和菌刺激表达 20-21 2.2.2.6 DNA的提取 21-22 2.2.2.7 MyBD基因的内含子边界的确定 22 2.3 实验结果 22-30 2.3.1 MyBD的cDNA全长序列及该基因编码的多肽序列分析 22-23 2.3.2 MyBD氨基酸的同源性比对分析 23-24 2.3.3 MyBD基因的进化分析 24-25 2.3.4 MyBD的组织分布 25-26 2.3.5 菌刺激后MyBD的相对表达量 26-27 2.3.6 MyBD的内含子序列 27-30 2.4 讨论 30-32 3 虾夷扇贝G-型溶菌酶基因的启动子克隆与分析 32-42 3.1 前言 32-33 3.2. 实验材料与方法 33-37 3.2.1 实验材料 33 3.2.2 实验方法 33-37 3.2.2.1 设计基因步移引物 33-34 3.2.2.2 虾夷扇贝DNA的提取 34 3.2.2.3 基因步移实验 34-36 3.2.2.4 确认并分析MyLysoG的启动子序列 36 3.2.2.5 MyLysoG基因启动子的单倍型分析 36-37 3.3 实验结果 37-41 3.3.1 MyLysoG的5’端序列 37 3.3.2 MyLysoG启动子序列的突变位点 37-39 3.3.3 MyLysoG启动子序列中的转录因子结合位点 39 3.3.4 不同虾夷扇贝个体的基因启动子单倍型 39-41 3.4 讨论 41-42 结论 42-43 参考文献 43-47 附录A 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 47-48 致谢 48
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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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