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干出胁迫下孔石莼上调表达基因消减cDNA文库的构建与分析

作　者: 杨帆
导　师: 侯和胜
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 孔石莼干出胁迫抑制消减杂交 cDNA文库实时荧光定量PCR
分类号: S917.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

为研究干出胁迫条件下孔石莼(Ulva pertusa)相关功能基因的差异表达情况,在实验室内模拟干出胁迫状态,以处理后的孔石莼为检测方(Tester),以正常生长(对照组)的孔石莼为对照方(Driver),利用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization, SSH)技术构建了孔石莼在干出胁迫下上调表达基因的消减cDNA文库。从孔石莼的消减cDNA文库中随机挑取160个克隆进行测序,共得到可以利用的EST片段是150条,它们占到总测序样品的93.8%。其中有21条为冗余序列(Redundant sequence, RS),137条为非冗余序列(Non-redundant sequence, NRS)且全为独立的EST片段(Singleton)。通过软件分析和序列比对发现,片段长度都集中在100-900bp间,平均长度为364bp。根据这些ESTs推导出的多肽序列与已知功能蛋白的氨基酸序列的相似度主要集中在20%-60%之间。其中,通过选取比对的22条EST序列发现,它们与已经完成基因组测序的高等植物及藻类的氨基酸序列相比有较高的相似性。获得的EST片段按其功能注释主要分为以下几大类：与细胞生长和发育相关,占22.63%；与蛋白合成及分解相关,占5.84%；与代谢相关,占7.30%；与胁迫应答相关,占5.11%；与光合作用和光诱导相关,占5.11%；与转录调节相关,占3.65%；与信号转导相关,占6.57%；未知功能,占24.09%；无对比结果,占19.71%；未知功能和无对比结果的序列共60条,占非冗余序列的43.80%,比例较高。对22条EST序列的密码子偏好性预测分析,计算结果显示孔石莼对密码子第三位各碱基的使用偏好无显著差异(P>0.05),GC使用总频率为50.66%,在所分析的序列中,孔石莼终止密码子明显偏好TGA。利用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR, RTq-PCR)技术对八氢番茄红素脱氢酶红素脱氢酶(Phytoene desaturase, PDS)、钙调素(Calmodulin, CaM)、14-3-3蛋白(14-3-3-like protein,1433s)及渗透活化蛋白激酶(Osmotic stress-activated protein kinase, OSAK)在干出胁迫处理前后的表达量差别进行分析,结果显示,这些基因表达量均随处理时间的增加而呈上调趋势。说明这些基因的表达调控在孔石莼抵御潮间带干出胁迫的分子响应机理过程中可能发挥了重要作用,这为阐释潮间带海藻在耐受不良环境胁迫的调控网络和分子机制方面提供了一定的参考依据。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-9
1 绪论  9-19
  1.1 孔石莼基础生物学  9-12
    1.1.1 孔石莼形态特征  9-10
    1.1.2 孔石莼的生活史  10-11
    1.1.3 孔石莼的药用及经济价值  11-12
  1.2 藻类响应干出胁迫的研究进展  12
  1.3 抑制性消减杂交  12-18
    1.3.1 抑制消减杂交技术基本原理  13-14
    1.3.2 抑制消减杂交技术基本流程  14-16
    1.3.3 抑制消减杂交技术主要优点及缺点  16-17
    1.3.4 抑制消减杂交技术在藻类基因研究中的应用  17-18
  1.4 本实验的研究内容、目的及意义  18-19
2 材料与方法  19-32
  2.1 材料采集及处理  19
    2.1.1 材料采集  19
    2.1.2 材料预培养  19
    2.1.3 材料胁迫处理  19
  2.2 仪器和试剂  19-20
    2.2.1 仪器  19-20
    2.2.2 试剂  20
  2.3 实验方法  20-32
    2.3.1 孔石莼叶状体总RNA提取、纯化及mRNA分离  20-22
    2.3.2 抑制消减杂交反应  22-27
    2.3.3 消减杂交PCR产物纯化  27
    2.3.4 连接与转化大肠杆菌感受态细胞  27-28
    2.3.5 阳性克隆筛选  28-29
    2.3.6 序列测定及分析  29
    2.3.7 实时焚光定量PCR  29-32
3 结果与分析  32-42
  3.1 消减cDNA文库构建  32-42
    3.1.1 孔石莼总RNA及mRNA电泳检测  32
    3.1.2 抑制消减cDNA文库检测  32-33
    3.1.3 菌液PCR检测  33-34
    3.1.4 消减文库基本信息分析  34-38
    3.1.5 密码子偏好性分析  38-39
    3.1.6 实时荧光定量PCR  39-42
4 讨论  42-45
结论  45-46
参考文献  46-51
附录A 附录内容名称  51-52
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  52-53
致谢  53

干出胁迫下孔石莼上调表达基因消减cDNA文库的构建与分析

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