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鲫鱼血清中可溶性瘦素受体的检测

作　者: 薛俊莲
导　师: 曹诣斌
学　校: 浙江师范大学
专　业: 动物学
关键词: 鲫鱼瘦素可溶性瘦素受体
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

瘦素(Leptin)是一种具有多种生理功能的神经免疫内分泌调节激素,由ob基因编码,由脂肪组织分泌进入血液,与一种短型受体结合后随血液循环跨过血脑屏障进入下丘脑,与特异性的瘦素受体(LPR)结合,通过激活某些特定的信号传递途径来抑制进食、增加能量消耗,此外还可通过与外周组织的瘦素受体(LPR)结合影响脂肪的分解合成和胰岛素抵抗等一系列机体代谢过程。因此,LPR对进一步发挥Leptin的生理功能起重要作用。Tartaglia LA于1995年运用表达克隆法首次从小鼠脉络丛cDNA表达文库中克隆出LPR,随后在鸟类和两栖动物中均已发现LPR。在硬骨鱼类中,最早由Wong等在海洋青鳉中克隆了Leptin长型受体的cDNA序列。随后,人们分别在河豚、日本青鳉、斑马鱼、大西洋鲑鱼、石斑鱼和黄颡鱼中克隆了Leptin长型受体的完整编码区,并从基因组定位、组织分布和发育表达调控等角度进行了初步研究。总体而言,目前关于鱼类瘦素受体的研究还很少。首先提取鲫鱼组织总RNA,通过RT-PCR获得Leptin基因,然后克隆到表达载体pGEX-4T-2中,在37℃、1mM IPTG条件下诱导表达,经检测大肠杆菌BL21(DE3)原核表达所得重组融合蛋白GST-Leptin以包涵体形式存在,表达量及可溶性几乎不受IPTG浓度变化的影响,但对温度的变化很敏感,随温度降低,表达量也大大减少。用8M尿素对包涵体进行变性处理,同时采用稀释复性和缓慢透析的方法使融合蛋白溶解,溶解的融合蛋白不能与GST Resin结合,可能是其没有完全恢复天然状态的构象。为此选择了标签较小的表达载体pET32a(+),经诱导发现在温度为25℃,IPTG浓度为0.1mM时,重组融合蛋白Trx-Leptin可溶性表达,可以用于Pull-down检测鲫鱼血清中的可溶性瘦素受体(sLR)。为了检测鲫鱼中的瘦素受体,根据鲫鱼Leptin长型受体胞外区第203-216和第632-645氨基酸序列,合成2条多肽,定期免疫动物,抽取血液,获得了相应的多克隆抗体,纯化后运用ELISA法检测抗体滴度,经检测抗体符合要求,分别用Anti-LPR203-216和Anti-LPR632-645检测鲫鱼不同组织中瘦素受体的表达水平,其中Anti-LPR203-216几乎检测不到信号,可能是该抗体不适用于Western Blot检测；Anti-LPR632-645检测结果表明鲫鱼肝脏中瘦素受体表达量明显高于鳃和肌肉,且在肝脏中检测到了瘦素受体的两种亚型,分子量分别约为110kD和90kD。通过RT-PCR获得了鲫鱼Leptin短型受体一种亚型的cDNA序列,与长型受体转录本相比,该短型受体转录本由于两个内含子未被剪切,导致其阅读框在跨膜区之前提前终止,可能编码Leptin可溶性受体蛋白(sLR)。Pull-down检测发现鲫鱼血清中存在该短型受体,分子量大约为115kD,比预期分子量大,推测sLR以糖蛋白的形式存在。多肽竞争性分析显示,用多肽孵育后抗体检测到的信号条带明显被抑制,证明抗体与目标蛋白的结合具有特异性。我们推测鱼类与人类和啮齿类动物不同,可能存在一种可溶性瘦素受体形成的新机制——“内含子滞留”,即在编码瘦素受体跨膜区的外显子上游有两个内含子滞留,提前引入一个终止密码子,使阅读框在到达跨膜区前被提前终止,编码Leptin的可溶性受体,并能够分泌到胞外,作为Leptin结合蛋白与Leptin结合。目前在鲤形目鱼类中尚没有关于可溶性Leptin受体的报道,本研究对鲫鱼Leptin可溶性受体的鉴定填补了鱼类Leptin受体研究在这方面的空白,也可为鱼类生产养殖活动中,更好地改善鱼类生长性能,提高鱼类品质,促进繁殖机能和调整鱼类摄食行为等提供理论依据。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-9
目录  9-12
符号说明  12-14
第一章绪论  14-24
  1 瘦素的研究进展  14-18
    1.1 瘦素的发现  14-15
    1.2 Leptin的结构  15-16
    1.3 Leptin的功能  16-17
    1.4 Leptin的组织分布  17-18
  2 瘦素受体  18-21
    2.1 瘦素受体基因的克隆  18
    2.2 瘦素受体的结构  18-19
    2.3 瘦素短型受体的功能  19-20
    2.4 瘦素受体的分布  20-21
  3 瘦素信号传导通路  21-22
    3.1 JAK-STAT代谢通路  21-22
    3.2 IRS-PI3K信号通路  22
  4 本研究的目的及意义  22-24
第二章鲫鱼LEPTIN的原核表达  24-50
  1 引言  24
  2 材料与方法  24-38
    2.1 主要试剂及相关溶液的配制  24-26
    2.2 主要仪器设备  26-27
    2.3 构建pGEX-4T-2-Leptin原核表达载体  27-34
    2.4 融合蛋白GST-Leptin的诱导表达  34-35
    2.5 融合蛋白GST-Leptin的可溶性检测  35-36
    2.6 包涵体的处理  36-37
    2.7 构建pET32a(+)-Leptin载体并表达  37
    2.8 融合蛋白Trx-Leptin的纯化  37-38
  3 结果与分析  38-48
    3.1 鲫鱼肝脏总RNA的提取  38
    3.2 鲫鱼肝脏Leptin目的基因的扩增  38-39
    3.3 重组表达载体pGEX-4T-2-Leptin的构建及鉴定  39
    3.4 融合蛋白GST-Leptin的诱导表达  39-42
    3.5 融合蛋白GST-Leptin的可溶性检测  42-44
    3.6 包涵体的提取及洗涤  44
    3.7 包涵体的变性、复性及目的蛋白的纯化  44-45
    3.8 重组表达载体pET32a(+)-Leptin的构建  45-46
    3.9 融合蛋白Trx-Leptin的诱导表达  46
    3.10 融合蛋白Trx-Leptin的可溶性检测及纯化  46-48
  4 讨论  48-50
第三章鲫鱼瘦素受体多克隆抗体的制备  50-60
  1 引言  50
  2 材料与方法  50-55
    2.1 主要试剂及溶液的配制  50-51
    2.2 主要仪器  51-52
    2.3 实验材料  52
    2.4 瘦素受体多克隆抗体的制备  52-53
    2.5 竞争性抑制法检测鲫鱼组织中瘦素受体  53-55
  3 结果与分析  55-57
    3.1 ELISA检测血清抗体滴度  55
    3.2 ELISA检测纯化抗体效价  55-56
    3.3 竞争性抑制法检测鲫鱼组织中瘦素受体  56-57
  4 讨论  57-60
第四章鲫鱼可溶性瘦素受体基因的克隆及其在血清中的鉴定  60-68
  1 引言  60-61
  2 材料与方法  61-64
    2.1 主要试剂及溶液  61
    2.2 主要仪器  61-62
    2.3 扩增鲫鱼Leptin短型受体cclpr-s2 cDNA序列并测序  62
    2.4 鲫鱼血清的获取  62
    2.5 Pull-down检测鲫鱼sLR  62-64
  3 结果与分析  64-66
    3.1 鲫鱼Leptin短型受体cclpr-s2的扩增  64-65
    3.2 鲫鱼血清sLR的检测  65
    3.3 多肽竞争性抑制法分析特异性  65-66
  4 讨论  66-68
结论  68-70
参考文献  70-84
致谢  84-86
攻读学位期间发表的学术论文  86-88

鲫鱼血清中可溶性瘦素受体的检测

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