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鮸鱼（Miichthys miiuy）自然杀伤细胞增强因子基因克隆及表达分析

作　者: 孟繁蔷
导　师: 徐田军
学　校: 浙江海洋学院
专　业: 海洋生物学
关键词: 鮸鱼 自然杀伤细胞增强因子（NKEF） 表达模式 蛋白质印迹（Westernblot）
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


自然杀伤细胞增强因子（Naturalkillerenhancingfactor,NKEF）于1993年在人类的红细胞中被分离纯化，成为了Peroxiredoxin(Prx)抗氧化蛋白家族一个重要的成员。因为在体外可以增强自然杀伤细胞对肿瘤细胞的细胞毒效应，所以被命名为自然杀伤细胞增强因子。为了研究硬骨鱼中NKEF的免疫防御机制，在本篇论文中，我们采用快速扩增cDNA末端（rapidamplificationofcDNAends,RACE）的方法，经过凝胶回收、连接、转化、阳性克隆子的检测和测序后，得到鮸鱼NKEF-A全长cDNA序列。鮸鱼NKEF-AcDNA全长为1235bp，其中包括47bp的5’非翻译区，597bp的开放阅读框和591bp的3’非翻译区，整个开放阅读框编码198个氨基酸。鮸鱼NKEF-A的蛋白分子量约为23kDa，在其蛋白质序列中，含有三个半胱氨酸残基（Cys），其中第52位和173位上的半胱氨酸残基分别存在于两个高度保守的VCP信号上，通过比对其他几种I类抗氧化蛋白家族成员后，发现这两个位置的半胱氨酸残基也是非常保守的，并且是Prx家族蛋白发挥其生物学功能的氨基酸区域。荧光定量PCR数据分析后表明，NKEF-A基因在鮸鱼十个正常组织中普遍表达，但是表达水平有着明显的差异。在不同时间段鳗弧菌感染的肝组织、脾组织和肾组织中，NKEF-A的表达水平均有所上调。最后，我们构建了重组表达载体pET-NKEF质粒，诱导重组质粒表达，确定最佳的诱导时间以及诱导浓度，纯化了重组蛋白。随后将纯化后的重组蛋白制备多克隆抗体，最后Westernblot测试分析显示制备的NKEF血清蛋白可以特异地识别重组蛋白。

全文目录


摘要  8-9
ABSTRACT  9-10
目录  10-12
第一章 文献综述  12-26
  1.1 ROS简述  12-15
    1.1.1 ROS的概念  12-13
    1.1.2 ROS产生的途径  13
    1.1.3 ROS的功能  13-14
    1.1.4 ROS的消除  14-15
  1.2 Prx家族概述  15-21
    1.2.1 Prx家族的分类概况  15-17
    1.2.2 Prx蛋白家族的功能及作用机制  17-21
  1.3 自然杀伤细胞增强因子  21-25
    1.3.1 NKEF的发现  21
    1.3.2 鱼类NKEF基因的发现及克隆  21-22
    1.3.3 NKEF的生物学功能  22-25
  1.4 鮸鱼NKEF基因研究的意义  25-26
第二章 鮸鱼NKEF基因的克隆  26-37
  2.1 实验材料与方法  26-30
    2.1.1 实验材料采集  26
    2.1.2 DNA/RNA的提取及cDNA的合成  26-27
    2.1.3 引物设计  27-29
    2.1.4 扩增鮸鱼NKEF-A基因  29
    2.1.5 扩增产物的回收与纯化  29-30
    2.1.6 目的片段的连接转化  30
    2.1.7 菌落PCR检测及测序  30
  2.2 实验结果  30-34
    2.2.1 DNA/RNA的提取  30
    2.2.2 鮸鱼NKEF-A基因的克隆  30-31
    2.2.3 鮸鱼NKEF-A基因的序列拼装与提交  31
    2.2.4 鮸鱼NKEF-A基因结构分析  31
    2.2.5 鮸鱼NKEF-A氨基酸序列比对分析  31-34
    2.2.6 鮸鱼NKEF-A进化树构建  34
  2.3 讨论  34-37
    2.3.1 鮸鱼NKEF-A基因的克隆  34-36
    2.3.2 鮸鱼NKEF-A基因氨基酸序列比对及系统发育树  36-37
第三章 鮸鱼NKEF-A基因的表达分析  37-42
  3.1 实验材料与方法  37-38
    3.1.1 实验材料的采集  37
    3.1.2 实验方法  37-38
  3.2 实验结果  38-40
    3.2.1 NKEF-A基因在鮸鱼不同组织中的表达  38-39
    3.2.2 鳗弧菌侵染后NKEF-A基因在组织中的表达  39-40
  3.3 讨论  40-42
第四章 鮸鱼NKEF-A基因蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备  42-55
  4.1 鮸鱼克隆载体pMD-NKEF-A质粒的构建  42-47
    4.1.1 材料和方法  42-45
    4.1.2 实验结果  45-47
  4.2 重组表达载体pET-NKEF质粒的构建  47-49
    4.2.1 实验方法  47-48
    4.2.2 实验结果  48-49
  4.3 重组质粒pET-NKEF的诱导表达  49-52
    4.3.1 实验方法  49-50
    4.3.2 实验结果  50-52
  4.4 多克隆抗体制备  52-53
    4.4.1 实验方法  52
    4.4.2 Westernblot分析  52-53
    4.4.3 实验结果  53
  4.5 讨论  53-55
参考文献  55-64
致谢  64-65
在读期间发表的学术论文及研究成果  65-66
附表  66-67

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