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海洋卡拉胶降解菌Cellulophaga sp.KL-A的筛选优化及卡拉胶酶研究

作　者: 古铮
导　师: 邵宗泽；单大鹏
学　校: 厦门大学
专　业: 动物学
关键词: Cellulophaga sp.KL-A 卡拉胶 ι-卡拉胶酶 ι-卡拉胶寡糖响应面优化
分类号: S917.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

卡拉胶(Carrageenan)是一种亲水性的多糖物质,从某些海藻细胞壁提取的、由β-1,3-D-半乳糖和α-1,4-D-半乳糖为基本骨架,交替连接所形成的线性硫酸多糖,主要分为三类：λ-(Lamda)型、ι-(Iota)型和κ-(Kappa)型。卡拉胶的降解产物寡糖具有广泛的生物活性,如免疫调节、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒等作用。卡拉胶降解酶是一种多糖水解酶,通过作用于卡拉胶的p-1,4糖苷键来水解卡拉胶,其水解产物主要为偶数卡拉胶寡糖。目前已报道的卡拉胶酶都归属于糖水解酶家族。对不同类型的卡拉胶酶结构及其功能、底物专一性等研究,具有重要的理论意义和实践价值。另外,利用卡拉胶酶也可以对卡拉胶硫酸基团的结构和功能之间的关系进行研究,对卡拉寡糖工业化应用、细菌卡拉胶代谢研究等方面也具有重要意义。而且酶解法制备卡拉胶寡糖的底物专一、条件温和,能解决传统化学和物理降解法不易控制、产物分布不均匀的缺点,从而为进一步研究卡拉胶寡糖的生物活性提供帮助。本论文从漳州市东山岛海域海水、养殖海水及红藻藻体上分离得到8株具有卡拉胶及琼胶降解功能的菌株,其中一株编号KL-A经平板划线,根据平板上水解圈的大小及发酵液酶活力的测定发现具有良好的专一性降解ι-卡拉胶能力。经过对菌株KL-A的16S rDNA测序鉴定,将其归属为Cellulophaga sp.,命名为Cellulophaga sp.KL-A。为了评价菌株的应用潜力,通过对菌株发酵液酶活的测定,响应面实验优化发酵产酶培养基,以提高菌株产酶能力。通过前期一些单因素的实验,结合相关参考文献中海洋细菌的发酵培养基成分,采用统计学响应面优化的方法找到能提高菌株发酵液酶活的最适培养基组成。得出最后优化的培养基中对产ι-卡拉胶酶影响最大的三个因素ι-carrageenan, glucose和CaCl2浓度分别是1.05g/L,14.73g/L和1.35g/L。最优培养基配方如下：1.05g/Lι-卡拉胶,14.73g/L葡萄糖,1.35g/L CaCl2,10g/L酵母粉,0.15g/L柠檬酸铁,4g/L MgSO4,0.06g/L SrCl2,0.06g/L K2HPO4。优化后,菌株KL-A生长的第72小时单位干重酶活达到最大值925.2U/g CDW,是在基础培养基中最大酶活值的20.6倍,是优化碳氮源后的酶活值的9.6倍。同时,菌株在优化培养基中菌体干重是基础培养基中的2.4倍。本文是首次对Cellulophaga属细菌通过响应面优化培养基提高ι-卡拉胶酶产量,且产酶能力显著提高。通过微生物全基因组测序,从Cellulophaga sp. KL-A基因组全序列中初步发现卡拉胶酶,琼胶酶基因相关的8个ORF,但没有发现琼胶酶活性,鉴于前期实验中菌株高效的降解ι-卡拉胶,所以对其ORF的序列中的两个ι-carrageenase基因克隆表达,并对其酶学性质和降解产物进行了研究。克隆得到的CgiA2_Ce基因序列全长1476bp,编码一个由491个aa残基组成的蛋白CgiA2_Ce。在线预测蛋白分子量大小为53.55kD,预测等电点为9.46。使用pET-32a (+)载体构建了CgiA2_Ce表达载体,重组质粒转入E.coli BL21(DE3)表达宿主菌中,成功构建重组工程菌,镍柱亲和层析纯化,得到ι-卡拉胶重组酶CgiA2_Ce。对ι-卡拉胶重组酶CgiA2_Ce的底物特异性的研究发现,重组酶CgiA2_Ce只能够专一性的降解ι-卡拉胶。该酶的最适反应温度为40℃,在37-43℃之间酶的相对活性保持在80%以上,在温度40℃或以下,放置1h,仍然能够保留其最大活力的80%以上。最适反应缓冲液体系为Tris-HCl buffer pH7.5。且重组酶展现了较广的pH耐受性,pH6.5-8.0范围内能保持最大活性的70%以上。金属离子K+和Mg2+对酶活力有轻微促进作用,而Na+和Ca2+有明显促进作用(34%-57%)。根据双倒数作图法对米氏常数的测定,得出当以ι-卡拉胶为底物时,得到的Km和Vmax值分别为0.93mg/mL和573.5U/mg。较小的米氏常数值Km和较大的Vmax值验证了ι-卡拉胶是重组ι-卡拉胶酶CgiA2_Ce较好的动力学反应底物。通过薄层色谱及质谱对水解产物进行分析,发现重组ι-卡拉胶酶CgiA2_Ce为内切酶,ι-卡拉胶最终水解产物主要为卡拉胶二糖和四糖。目前研究的所有卡拉胶降解酶都是以内切的方式降解卡拉胶。内切卡拉胶降解酶将大分子量的卡拉胶降解为低粘度的小分子量的寡糖。通过摸索加入酶的量以及对酶解反应时间进行控制为取得一些高聚合度的寡糖和低聚和度、单一的寡糖提供了可能。

全文目录

目录  4-7
Contents  7-10
摘要  10-12
Abstract  12-15
第一章前言  15-41
  1.1 海洋多糖及多糖水解酶  15
  1.2 卡拉胶结构、性质及应用  15-22
    1.2.1 卡拉胶的结构组成与分类  16-18
    1.2.2 卡拉胶的理化性质  18-21
    1.2.3 卡拉胶的应用  21-22
  1.3 卡拉胶寡糖  22-27
    1.3.1 卡拉胶寡糖的制备方法  22-24
    1.3.2 卡拉胶寡糖的分离纯化与寡糖结构的鉴定方法  24-25
    1.3.3 卡拉胶寡糖的生物活性  25-27
  1.4 卡拉胶酶  27-36
    1.4.1 卡拉胶降解酶的研究进展  28-33
    1.4.2 卡拉胶酶的应用  33-35
    1.4.3 卡拉胶降解酶的应用前景展望  35-36
  1.5 菌株发酵产酶的优化方法  36-39
    1.5.1 非统计学方法  36
    1.5.2 统计学方法  36-39
  1.6 本论文的研究思路、目的与意义  39-41
第二章 ι-卡拉胶降解细菌的筛选鉴定及其产酶培养基的统计学优化  41-67
  2.1 实验材料  41-42
    2.1.1 菌株  41
    2.1.2 培养基  41
    2.1.3 试剂  41-42
  2.2 实验方法  42-48
    2.2.1 卡拉胶降解细菌的筛选  42
    2.2.2 产卡拉胶酶细菌的鉴定  42-43
    2.2.3 卡拉胶酶活力的测定  43-45
    2.2.4 卡拉胶酶培养基的统计学优化  45-48
  2.3 实验结果  48-65
    2.3.1 卡拉胶降解细菌KL-A的分离与鉴定  48-51
    2.3.2 Cellulophaga sp.KL-A产卡拉胶酶培养基的统计学优化  51-65
  2.4 小结与讨论  65-67
第三章 Cellulophaga sp.KL-A中ι-卡拉胶酶CgiA2_Ce的克隆表达与酶学性质的研究  67-95
  3.1 实验材料  67-71
    3.1.1 菌株、质粒和感受态细胞  67
    3.1.2 主要试剂  67
    3.1.3 主要仪器  67-68
    3.1.4 引物  68
    3.1.5 培养基  68-69
    3.1.6 溶液及缓冲液  69-71
    3.1.7 主要分析软件  71
  3.2 基本方法  71-79
    3.2.1 细菌基因组DNA的提取  71
    3.2.2 PCR扩增体系及程序  71-72
    3.2.3 PCR产物切胶回收纯化  72
    3.2.4 目的片段与载体连接  72
    3.2.5 感受态细胞的制备(化学转化)  72-73
    3.2.6 克隆质粒转入感受态细胞  73
    3.2.7 限制性内切酶酶切反应  73-74
    3.2.8 重组表达的载体pET32a(+)-CgiA2_Ce的构建  74
    3.2.9 重组ι-卡拉胶酶CgiA2_Ce的表达和纯化  74-75
    3.2.10 重组ι-卡拉胶酶CgiA2_Ce的酶学性质研究  75-76
    3.2.11 重组酶酶促反应动力学参数的测定  76-78
    3.2.12 重组ι-卡拉胶酶CgiA2_Ce降解方式及降解产物的研究  78-79
  3.3 实验结果与分析  79-91
    3.3.1 Cellulophaga sp.KL-A的全基因组序列分析及CgiA2_Ce序列比对分析  79-82
    3.3.2 重组表达载体的体系构建  82-84
    3.3.3 重组酶CgiA2_Ce的表达和分离纯化  84-85
    3.3.4 重组ι-卡拉胶酶CgiA2_Ce酶学性质研究  85-89
    3.3.5 重组酶CgiA2_Ce降解方式及降解产物的分析  89-91
  3.4 小结与讨论  91-95
第四章总结与展望  95-98
参考文献  98-110
致谢  110

海洋卡拉胶降解菌Cellulophaga sp.KL-A的筛选优化及卡拉胶酶研究

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