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鹅源粪肠球菌efaA基因的克隆表达和生物信息学分析

作　者: 曾钰然
导　师: 高原
学　校: 内蒙古民族大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 粪肠球菌 鹅 efaA基因 克隆 effaA蛋白 原核表达 生物信息学分析
分类号: S858.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：构建鹅源粪肠球菌efaA基因的原核表达载体,在大肠球菌工程菌BL21中表达,对所表达的efaA蛋白进行免疫原性检测及生物信息学分析。方法：提取粪肠球菌标准株与分离株的总DNA,做扩增模板；登陆GenBank,根据其公布的粪肠球菌心内膜炎抗原的碱基序列,应用Primer Premier5.0与Oligo6.0软件设计一对efaA的特异性引物；摸索PCR扩增条件扩增成功后,进行凝胶电泳分离并回收目的片段；将该片段与pMD18-T克隆载体连接,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞；筛选阳性克隆菌,提取质粒,进行PCR和单双酶切鉴定,确证克隆成功后送公司测序。酶切克隆成功的pMD18-T-efaA重组质粒,构建pET-28a-efaA重组质粒并将其转至大肠杆菌BL21感受态细胞中：筛选pET-28a-efaA/BL21阳性菌株,分别在不同浓度、时间及温度条件下诱导表达,确定最佳诱导条件；通过蛋白电泳SDS-PAGE鉴定确证后,用镍柱纯化,得到纯化的efaA蛋白。用SDS-PAGE和Western blot两种方法鉴定efaA蛋白。对表达的efaA氨基酸序列进行生物信息学分析：根据对efaA氨基酸组分、分子质量、滴定曲线与等电点等分析,预测其一级结构中糖基化位点等,根据对其可塑性、亲水性、抗原性指数和表面可及性以及p-转角、无规则卷曲等的综合分析,预测潜在抗原表位。结果：成功克隆了鹅源粪肠球菌菌株心内膜炎抗原efaA基因,其碱基序列为726bp,编码242个氨基酸。成功构建了pET-28a-efaA/BL21表达载体,确定最佳诱导条件为,IPTG终浓度1.0mmol/L、温度28℃、时间4h,所表达的蛋白为30KD,大小与预期一致。SDS-PAGE和Western blot鉴定,efaA蛋白为30KD,与预期一致。鹅源粪肠球菌efaA蛋白的第13～19、26～33、66～73、92-105、141～149、152-164、190-200、210～260位氨基酸,其亲水性指数＞0、AI≥0、表面可及性＞1,具有β-折叠和无规则卷曲,是efaA蛋白的B细胞潜在抗原表位。结论：成功克隆了鹅源粪肠球菌efaA基因,表达了efaA蛋白,确定了表达最佳条件,综合预测了efaA蛋白的B细胞潜在抗原表位。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
縮略语表  8-9
第一章 文献综述  9-16
  1.1 粪肠球菌性心内膜炎及其致病因子  9-13
  1.2 常见粪肠球菌感染与疾病  13-14
  1.3 粪肠球菌耐药性  14-15
  1.4 生物信息学简介  15-16
第二章 鹅源粪肠球菌efaA的基因克隆与序列分析  16-28
  2.1 材料和方法  16-22
    2.1.1 菌种  16
    2.1.2 主要试剂  16
    2.1.3 试验仪器  16-17
    2.1.4 试验流程  17-22
    2.1.5 重组质粒序列测定与分析  22
    2.1.6 efaA基因核苷酸序列分析  22
  2.2 试验结果  22-26
    2.2.1 PCR鉴定结果  22-23
    2.2.2 pMD18-T-efaA重组质粒单双酶切鉴定结果  23
    2.2.3 efaA基因测序结果  23-25
    2.2.4 efaA基因核苦酸序列分析结果  25-26
  2.3 讨论  26-27
  2.4 结论  27-28
第三章 鹅源粪肠球菌efaA基因的原核表达及蛋白检测  28-44
  3.1 材料和方法  28-37
    3.1.1 菌种和载体  28-29
    3.1.2 主要试剂  29
    3.1.3 主要仪器  29-30
    3.1.4 试验动物  30
    3.1.5 试验方法  30-37
      3.1.5.1 试验流程  30-31
      3.1.5.2 原核表达重组质粒pET-28a-efaA的构建  31-33
      3.1.5.3 efaA蛋白的表达和检测  33-35
      3.1.5.4 Western blot检测目的蛋白  35-37
  3.2 试验结果  37-42
    3.2.1 efaA蛋白SDS-PAGE检测结果  37-38
    3.2.2 efaA蛋白诱导条件优化结果  38-40
    3.2.3 efaA蛋白可溶性分析结果  40-41
    3.2.4 efaA蛋白纯化结果  41
    3.2.5 efaA蛋白的Western blot检测结果  41-42
  3.3 讨论  42-43
  3.4 结论  43-44
第四章 鹅源粪肠球菌efaA基因的生物信息学分析  44-54
  4.1 材料和方法  44-46
    4.1.1 材料  44
    4.1.2 生物信息学软件和网络服务器  44
    4.1.3 方法  44-46
      4.1.3.1 鹅源粪肠球菌efaA蛋白序系统进化分析  44
      4.1.3.2 鹅源粪肠球菌efaA蛋白序列的理化性质的分析  44-45
      4.1.3.3 鹅源粪肠球菌efaA蛋白序列结构的预测  45
      4.1.3.4 鹅源粪肠球菌efaA蛋白抗原表位的预测  45
      4.1.3.5 鹅源粪肠球菌efaA mRNA二级结构的预测  45-46
  4.2 结果  46-52
    4.2.1 鹅源粪肠球菌efaA蛋白序系统进化分析结果  46
    4.2.2 鹅源粪肠球菌efaA蛋白序列的理化性质分析结果  46-48
    4.2.3 鹅源粪肠球菌efaA蛋白结构  48-50
    4.2.4 鹅源粪肠球菌efaA蛋白抗原表位  50-51
    4.2.5 鹅源粪肠球菌efaA mRNA二级结构  51-52
  4.3 讨论  52-53
  4.4 结论  53-54
参考文献  54-62
致谢  62-63
导师简介  63-64
作者简介  64-65

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鹅
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