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抗鹌鹑IgG单克隆抗体的制备与应用

作　者: 罗燕
导　师: 金文杰
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鹌鹑IgG 单克隆抗体 IFA 间接ELISA 层析试纸条
分类号: S858.39
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

鹌鹑的肉和蛋中含有丰富的蛋白质,具有较高的营养价值和药用价值,在我国更是有“动物人参”的美誉。我国鹌鹑养殖业从20世纪80年代开始,经过几十年的发展,其规模已经仅次于鸡。随着养殖规模的发展鹌鹑的各种疾病也有越来越严重的趋势,给鹌鹑养殖业带来了巨大的经济损失,因而对常见疾病进行预防和监测控制日益引起养殖业者的关注,针对不同病原抗体水平的检测评估也成为了养殖环节的重要工作。IgG在抗体分子总量中占70%-80%,是组分中比例最高的,在抵抗不同病原的入侵中也起着主力军的作用。血清中针对不同病原特异性IgG水平的测定已经成为临床免疫检测和体液免疫研究的常用指标。现今市场上出售的抗体检测试剂盒主要是用于鸡源疾病的检测,而关于鹌鹑疾病检测的试剂盒几乎没有,而且国内外至今也没有关于抗鹌鹑IgG的单抗制备的报道。本研究制备了抗鹌鹑IgG的单克隆抗体,并以此单抗为介导建立了检测鹌鹑体内NDV抗体的三种方法：IFA、间接ELISA和胶体金免疫层析试纸条,结果显示建立的三种方法都具有较好的灵敏性和特异性,可用于临床检测。研究内容一：抗鹌鹑IgG单克隆抗体的制备以饱和硫酸铵法纯化得到的鹌鹑IgG为免疫原,按照常规方法免疫6-8周龄Balb/c小鼠,经过三次免疫后无菌取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合,采用间接酶联免疫吸附试验筛选阳性杂交瘤细胞,用有限稀释法进行了两次亚克隆,共获得4株稳定分泌抗鹌鹑IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为：QIgG-5F11、QIgG-5G2、QIgG-5G6和QIgG-3D4。亚类鉴定试剂盒结果显示QIgG-5F11和QIgG-5G2的亚类为IgG1,而另两株为IgM,四株单克隆抗体的轻链均为K链。用ELISA方法测定了单抗的效价,4株单抗的上清效价分别为：1：2048、1：4096、1：2048和1：1024,腹水的效价分别为：1：409600、1：204800、1：409600和1：102400。用Western-blot检测单抗的反应性,结果显示QIgG-5F11和QIgG-5G2均特异性识别鹌鹑IgG的轻链,而QIgG-5G6和QIgG-3D4均特异性识别鹌鹑IgG的重链。本研究用间接ELISA和Western-blot对不同动物的血清免疫球蛋白进行了交叉反应性的测定,结果显示,两株单抗QIgG-5F11和QIgG-5G2的腹水均只与鹌鹑血清中的免疫球蛋白发生反应,与其他几种动物的血清之间不存在反应性,表明本研究制备的抗鹌鹑IgG单克隆抗体具有较好的特异性。本研究制备的抗鹌鹑IgG单克隆抗体与鹌鹑血清中抗体的良好反应性和特异性,使其有望成为鹌鹑血清中抗体检测的通用二抗,使得检测鹌鹑血清抗体通用试剂盒的研制成为可能,从而服务于临床检测。研究内容二：抗鹌鹁IgG单克隆抗体的应用本研究以研究内容一中制备的单抗QIgG-5F11为介导,以NDV抗体检测为例,尝试建立检测鹌鹑血清中抗体的IFA法、间接ELISA法和层析试纸条法。(1)以感染了LaSota的CEF为固定抗原,鹌鹑血清为一抗,单抗QIgG-5F11为抗抗体,再用FITC标记的羊抗鼠IgG为荧光二抗建立了检测鹌鹑血清中的NDV抗体的IFA法。(2)以超离纯化的NDV病毒为包被抗原,鹌鹑血清为一抗,以HRP标记的QIgG-5F11为二抗建立了检测鹌鹑血清中NDV抗体水平的间接ELISA法。(3)用胶体金标记QIgG-5F11包被金标垫,将纯化的NDV和兔抗鼠IgG分别喷于NC膜的T线和C线,建立了检测鹌鹑血清中的NDV抗体的层析试纸条。三种方法建立后分别对实验室和临床采集的鹌鹑血清进行了检测,将三种方法的结果与HI的结果进行对比分析,结果显示三种方法与HI的符合率分别为69.8%、91.4%和95.8%,表明建立的三种方法均达到了预期的效果,能对鹌鹑血清中的NDV抗体水平进行检测评估。通过三种方法的建立和应用,证明了本研究制备的抗鹌鹑IgG的单克隆抗体具有实用性。本研究中以检测NDV抗体为例证明制备的抗鹌鹑IgG的单克隆抗体可以用于检测鹌鹑血清中存在的抗体,以此类推,我们可以将本研究制备的单抗应用于针对其他病原抗体检测方法的建立,可以在临床进行推广应用。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-7
符号说明  7-10
文献综述  10-21
  综述一鹌鹑及其常见病原  10-14
  综述二抗各种动物IgG单抗的研究进展  14-21
研究内容一抗鹌鹑IgG单克隆抗体的制备  21-33
  摘要  21-22
  1 材料  22-23
  2 方法  23-28
  3 结果  28-31
  4 小结与讨论  31-33
研究内容二抗鹌鹑IgG单克隆抗体在检测鹌鹑血清中NDV抗体的应用  33-49
  摘要  33
  1 材料  33-35
  2 方法  35-41
  3 结果  41-46
  4 小结与讨论  46-48
  5 展望  48-49
主要研究成果  49-50
参考文献  50-56
致谢  56-57

抗鹌鹑IgG单克隆抗体的制备与应用

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