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检测致产蛋下降的鸭呼肠孤病毒抗原或抗体的ELSIA方法的建立

作　者: 孙陈莉
导　师: 吴艳涛
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭呼肠孤病毒原核表达间接ELISA 单克隆抗体双抗体夹心ELISA
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

呼肠孤病毒感染可引起鸭的以头颈肿胀、眼结膜充血(出血)、全身皮肤广泛出血等为主要特征的传染病,被国内外视为危害养鸭业健康发展的重要疫病之一。2010年起,我国南方地区蛋鸭中陆续发生临床主要表现为产蛋下降的传染性疾病,本实验室从发病鸭群中分离、鉴定了呼肠孤病毒。为了对致产蛋下降的鸭呼肠孤病毒(duck reovirus, DRV)进行诊断和防控,本研究分别建立了检测DRV抗原和抗体的方法,包括两个方面：一是以大肠杆菌表达的DRV σB蛋白作为包被抗原,建立检测DRV抗体的间接ELISA方法；二是研制针对DRV的单克隆抗体,建立检测DRV抗原的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法。采用RT-PCR扩增DRV ZY/AH/1/2011株的σB基因,克隆到原核表达载体pET-32a(+),再转化大肠杆菌Transetta(DE3)。含有重组质粒pET-σB的大肠杆菌经IPTG诱导,获得大小为55ku的以包涵体形式表达的重组σB蛋白。Western-blotting显示重组σB蛋白能够与兔抗DRV多抗血清特异性结合。以高亲和NI-NTA树脂在变性条件下纯化重组σB蛋白,并用梯度尿素复性。将纯化的重组σB蛋白作为包被抗原,建立了检测鸭血清中DRV抗体的间接ELISA方法。以该方法和血清中和试验对DRV感染鸭血清和SPF鸭血清进行检测,两者的符合率为100%。该方法与鸭瘟病毒、雏鸭肝炎病毒和禽流感病毒的阳性血清均无交叉反应,批内变异系数小于11%、批间变异系数小于14%。采用差速离心和蔗糖密度梯度超速离心提纯DRVZY/AH/1/2011,将其作为抗原免疫8周龄BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0进行细胞融合。以纯化的重组σB蛋白作为检测抗原筛选阳性克隆,经有限稀释法亚克隆3-4次,获得了6株稳定分泌抗DRV单克隆抗体的杂交瘤细胞,依次命名为：2D7、2D10、2B11、6B2、4D7、7H9。经鉴定单抗效价达1：1600～1：51200；其中单抗2D10的亚类为IgG1、其余5株单抗的亚类为IgG3;间接免疫荧光试验显示6株单抗与感染DRV的Vero细胞产生特异性反应；Western-blotting显示6株单抗能够与重组σB蛋白特异性结合；单抗2D10与6B2、4D7可能识别不同的抗原决定簇。分别以Protein G树脂纯化的DRV兔多抗血清和2D10单抗为捕获抗体和检测抗体,建立了检测DRV抗原的双抗体夹心ELISA (DAS-ELISA)方法。该检测方法的敏感性达0.522μg/mL,与鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒和禽流感病毒均无交叉反应,批内和批间变异系数均小于10%。上述结果表明,本研究建立的检测致产蛋下降DRV的抗原或抗体方法具有良好的敏感性、特异性和重复性。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
符号说明  9-11
综述  11-18
第一章检测鸭呼肠孤病毒抗体的间接ELISA方法的建立  18-30
  1 材料  18-19
    1.1 细胞系、毒株及实验动物  18
    1.2 菌株、载体和血清  18
    1.3 主要试剂  18-19
    1.4 仪器  19
  2 方法  19-22
    2.1 DRV的扩增和纯化  19
    2.2 DRV多抗血清的制备  19-20
    2.3 σB蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化  20-21
    2.4 检测DRV抗体的间接ELISA方法的建立  21-22
  3 结果  22-28
    3.1 DRV的扩增和纯化  22
    3.2 DRV多抗血清的制备  22
    3.3 σB蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化  22-26
    3.4 检测DRV抗体的间接ELISA方法的建立  26-28
  4 讨论  28-30
第二章检测鸭呼肠孤病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法的建立  30-42
  1 材料  30-31
    1.1 细胞系、毒株及实验动物  30
    1.2 主要试剂  30
    1.3 仪器  30-31
  2 方法  31-35
    2.1 特异性单克隆抗体的制备  31-33
    2.2 单克隆抗体的鉴定  33-34
    2.3 检测DRV抗原的DAS-ELISA方法的建立  34-35
  3 结果  35-40
    3.1 特异性单克隆抗体的制备  35
    3.2 单克隆抗体的鉴定  35-39
    3.3 检测DRV抗原的DAS-ELISA方法的建立  39-40
  4 讨论  40-42
全文总结  42-43
参考文献  43-48
致谢  48-49

检测致产蛋下降的鸭呼肠孤病毒抗原或抗体的ELSIA方法的建立

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