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鸭减蛋综合征PCR检测方法建立及西南地区血清流行病学调查

作　者: 罗念
导　师: 蒋文灿
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭减蛋综合征 PCR检测血凝抑制试验血清流行病学调查
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

减蛋综合征(Egg Drop Syndrome,EDS76)是由禽腺病毒Ⅲ群引起的能使蛋禽产蛋量严重下降的一种病毒性传染病。自1976年荷兰科学家Van Eck首次发现减蛋综合征病毒(Egg Drop Syndrome virus,EDSV)以来,许多国家也相继在鸡上分离出多株病毒。大多数学者认为该病易感动物是鸡,鸭只是病毒的贮藏宿主,但自从Bartha等1984年首次从表现产蛋下降和严重腹泻的鸭中分离到病毒以来,国内外对鸭减蛋综合征的研究愈来愈多,表明在一定条件下,鸭感染EDS76病毒后也可引起严重的产蛋下降。本试验从西南地区的云贵川三省的不同地区采集鸭血,通过对血清做血凝抑制试验检测EDSV抗体和白细胞层DNA做PCR试验检测EDSV抗原,旨在探讨西南地区鸭减蛋综合征的感染情况,为西南地区减蛋综合征病毒的预防监控、分子生物学研究与DNA疫苗的研制提供重要依据。1.鸭减蛋综合征PCR检测方法的建立本次研究参照GenBank中收录的鸭源减蛋综合征病毒127分离株(Y09598)的100k蛋白基因的保守区,设计一对理论跨幅为280bp的引物,通过对Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶浓度、模板量、变性温度、退火温度、延伸温度、循环次数进行优化,得到PCR的最佳反应模式：25μL反应体系分别加入：10×PCR Buffer2.5μL,25mmol/L MgCl22μL, dNTPs(2.5mmol/L)2μL,引物Ⅰ、引物Ⅱ(浓度均为10pmol/μL)均为1μL, Tap酶0.5μL,模板DNA2μL,再加ddH2O至25μL。反应程序为：94℃5min,94℃30s→55℃30s→72℃1min,运行31个循环,最后于72℃延伸7min。以鸭病毒性肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)、鸭源致病性大肠埃希氏菌(pathogenicity Escherichia coli, E.coli)、鸭源致病性沙门氏菌(pathogenicity Salmonella, Sal.)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)为对照的特异性实验以及对母鸭攻毒检测其组织带毒情况证明该检测方法确实有效,且有较高的特异性。敏感性实验结果显示该方法可以检测出的最低DNA模板浓度为14.25pg/mL,说明其敏感性很好,可用于鸭减蛋综合征病毒临床的快速检测并将此方法运用到西南地区鸭减蛋综合征抗原检测。通过对西南地区鸭血样进行PCR试验,结果为肉用型鸭和蛋用型鸭阳性率分别为18.1%和21.6%,说明阳性率较高,与鸭是EDSV的贮藏宿主这一理论基本一致,为西南地区鸭减蛋综合征的防御提供了数据参考和理论指导。将检测到的阳性样品按每个省随机选取一个,测序之后进行生物信息学分析其基因和氨基酸生物学特征,与100K蛋白的生物学特征基本一致,与鸭源减蛋综合征病毒127分离株(Y09598)进行比对,其同源性高达98%以上,说明EDSV的地域性不强。2.西南地区鸭减蛋综合征血清流行病学调查西南地区主要采集云、贵、川三省,每省均采集省会以及代表东南西北四个区域的五个点。每个点采集肉用型和蛋用型母鸭血各10份以上。总共采集16个地区的193例肉用型鸭血样和199例的蛋用型鸭血样。运用血凝抑制试验对这392份样品进行检测。结果显示肉用鸭和蛋用鸭阳性只数分别为22和29,阳性率分别为11.4%和14.6%。说明蛋用鸭比肉用鸭易感此病毒。其中三省阳性率对比得出蛋用型鸭四川地区阳性率最高,肉用型鸭云南地区阳性率最高,说明这三个省均应加强对此病的防疫工作,也给各个地区针对鸭减蛋综合征的防疫工作做了一定的数据指导。通过对母鸭进行攻毒之后不同时间的抗体和抗原检测,对母鸭感染EDSV之后抗体水平和组织带毒情况有了一定的了解,结果显示攻毒7天后HI抗体效价较高,到14天达到最高峰,21天时有一定的下降,HA试验显示除了心脏没有检测到抗原,其他组织HA试验滴度都较高,说明EDSV感染鸭后的7-21天为排毒高峰期,为临床上鸭减蛋综合征疫苗的研发和临床应用方面提供科学依据。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
缩略词表  9-14
文献综述  14-20
  1 减蛋综合征病毒分类  14
  2 流行病学特点  14-15
  3 EDSV病原特性  15
  4 EDSV100K蛋白结构与功能  15-16
  5 减蛋综合征的诊断和检测技术  16-19
    5.1 临床诊断  16
    5.2 剖检诊断  16-17
    5.3 实验室诊断  17-19
      5.3.1 病原分离和鉴定  17
      5.3.2 清学诊断  17-18
      5.3.3 分子生物学诊断  18-19
  6 以EDSV作为基因工程载体的研究  19-20
研究目的与意义  20-21
第一章鸭减蛋综合征PCR检测方法的建立及对样品的检测  21-44
  1 材料  21-23
    1.1 试验毒株、菌株  21
    1.2 实验动物  21
    1.3 实验试剂  21
    1.4 试验耗材及主要仪器  21-22
    1.5 溶液的配制  22-23
      1.5.1 生理盐水的配制  22
      1.5.2 pH 7.20.01 mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)  22
      1.5.3 6×上样缓冲液  22
      1.5.4 50×TAE  22-23
    1.6 样品采集  23
      1.6.1 采集地选取  23
      1.6.2 血样处理  23
  2 试验方法  23-28
    2.1 引物的设计与合成  23
    2.2 病毒增殖  23
    2.3 病毒DNA抽提  23-24
    2.4 病毒DNA浓度和纯度测定  24
    2.5 PCR反应条件的优化  24-25
    2.6 PCR产物的鉴定  25-26
      2.6.1 电泳鉴定  25
      2.6.2 测序鉴定  25-26
    2.7 PCR特异性试验  26
      2.7.1 检测其他抗原  26
      2.7.2 实验感染母鸭各脏器的PCR检测  26
    2.8 PCR敏感性试验  26
    2.9 将建立的PCR检测方法用于血样检测  26-27
      2.9.1 凝块白细胞层DNA的提取  26-27
      2.9.2 样品DNA的PCR检测  27
    2.10 阳性样品测序并进行生物信息学分析  27-28
      2.10.1 核苷酸序列分析  27
      2.10.2 氨基酸序列分析  27-28
  3 试验结果  28-41
    3.1 PCR反应条件优化结果  28
    3.2 PCR产物的鉴定  28-29
    3.3 PCR特异性试验  29-31
      3.3.1 检测其他抗原  29-30
      3.3.2 实验感染母鸭各脏器的PCR检测  30-31
    3.4 PCR敏感性试验  31-32
    3.5 样品PCR检测结果  32
    3.6 阳性样品测序并进行生物信息学分析  32-41
      3.6.1 阳性样品测序结果  32-34
      3.6.2 核苷酸序列分析  34-36
      3.6.3 氨基酸序列分析  36-41
  4 分析与讨论  41-43
  5 小结  43-44
第二章西南地区鸭减蛋综合征血清学调查  44-53
  1 试验材料  44-46
    1.1 标准抗原、阳性血清  44
    1.2 试验动物  44
    1.3 试验耗材及主要仪器  44-45
    1.4 溶液的配制  45-46
      1.4.1 生理盐水的配制  45
      1.4.2 血细胞保护液(阿氏液)  45
      1.4.3 1%鸡红细胞悬液的配制  45
      1.4.4 pH7.20.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)  45-46
    1.5 样品采集  46
      1.5.1 采集地选取  46
      1.6.2 样处理  46
  2 试验方法  46-48
    2.1 抗原凝集效价测定  46
    2.2 配制抗原工作液  46-47
    2.3 血凝抑制试验  47
    2.4 结果判定  47-48
      2.4.1 当对照出现下列结果时试验成立  47-48
      2.4.2 判定标准  48
    2.5 人工感染母鸭组织带毒检测  48
  3 试验结果  48-51
    3.1 血凝抑制试验结果  48-50
    3.2 人工感染母鸭组织带毒检测  50-51
  4 分析与讨论  51-52
  5 小结  52-53
全文结论  53-54
主要参考文献  54-57
致谢  57-58
研究生期间发表论文  58

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