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鸭甲肝病毒1型和3型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其在雏鸭体内动态分布规律的研究

作　者: 李井新
导　师: 姜世金
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 1型鸭甲肝病毒（DHAV-1） 3型鸭甲肝病毒（DHAV-3）一步法实时荧光定量RT-PCR 动态定量分布
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

鸭甲肝病毒（Duck Hepatitis AVirus, DHAV）是一种引起雏鸭鸭病毒性肝炎（Duckviral hepatitis, DVH）的主要病原。鸭病毒性肝炎主要以雏鸭发生肝炎为病理特征，具有高度传染性和接触性，发病迅速死亡率高，呈世界性分布。在我国鸭病毒性肝炎主要有DHAV-1和DHAV-3引起，两种病毒感染雏鸭发病后的临床症状和病理变化非常相似，并且二者在临床症状混合感染情况比较普遍，给该病的正确诊断和防治带来了极大的困难。本研究建立了分别检测DHAV-1与DHAV-3的两种一步法荧光定量RT-PCR方法，并对DHAV-1和DHAV-3在雏鸭体内的动态分布情况进行了研究。本研究主要包括两部分：1.检测DHAV-1与DHAV-3的一步法荧光定量RT-PCR方法的建立根据DHAV-1和DHAV-3基因组序列，分别设计合成了两对能特异性扩增片段的引物和对应的两条TaqManTM探针，建立了两种分别检测DHAV-1和DHAV-3的一步荧光定量RT-PCR诊断方法。两种方法的反应体系及优化条件均一致，可以同时进行检测DHAV-1和DHAV-3。检测DHAV-1方法中标准曲线为Y=-3.02x+30.153，相关系数为0.999，PCR循环效率为1.17%，在6.32×102～6.32×107copies/μL内有良好的线性关系，检测DHAV-1病毒RNA模板的灵敏度为63copies/μL；检测DHAV-3方法中标准曲线为Y=-2.9571x+29.8，相关系数为0.999，PCR循环效率为1.14%，在3.88×103～3.88×108copies/μL内有良好的线性关系；具有良好重复性及敏感性，检测DHAV-3病毒RNA模板的灵敏度为38copies/μL；特异性试验结果显示，两种分别检测DHAV-1和DHAV-3方法只能从对应的阳性样本中扩增出特异片段，表明只对其相应基因组呈阳性反应，对被检的其它无关病原或鸭健康组织呈阴性反应。分别应用该方法和常规RT-PCR方法检测20份人工感染DHAV-1和DHAV-3雏鸭肝脏以及50份临床疑似患DVH病鸭的肝脏，结果显示：两种方法对人工感染DHAV-1和DHAV-3雏鸭的阳性率均为100%，对50份疑似患鸭病毒性肝炎病鸭的肝脏的临床样本阳性检出率要高于双重RT-PCR方法。研究结果表明建立的两种荧光定量RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于快速鉴别诊断DHAV-1和DHAV-3以及对人工感染雏鸭体内病毒的实时定量检测。2. DHAV-1和DHAV-3在雏鸭体内的动态分布规律研究将150只3日龄健康雏鸭随机分为5组，每组30只，每组分别每只雏鸭经肌肉注射接种2ELD50的DHAV-1、DHAV-3、1ELD50的DHAV-1和DHAV-3、2ELD50的DHAV-1和DHAV-3以及生理盐水。人工感染后lh、2h、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h十个时间点定期取每组雏鸭3只，分别采集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺和法氏囊，应用建立的一步荧光定量RT-PCR法定量检测DHAV-1和DHAV-3的雏鸭体内病毒动态分布情况。结果表明：单独感染DHVA-1组和单独感染DHVA-3组最早分别可在l h和6h内从肝脏中检测到病毒，12～72h之间各组织器官均能检测到相应病毒，24～48h病毒含量最高。雏鸭混合感染DHAV-1、DHAV-3与分别单独感染在雏鸭体内被检组织器官最高峰出现的时间规律大体一致。

全文目录

符号说明  4-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-11
1 前言  11-26
  1.1 鸭甲肝病毒的分类地位  11-12
  1.2 鸭甲肝病毒的生物形态学及理化特性  12-13
    1.2.1 形态结构与生物学特性  12
    1.2.2 理化特性  12
    1.2.3 培养特性  12-13
  1.3 DHAV 基因组结构与功能  13-17
    1.3.1 DHAV 基因组非编码区  14-15
    1.3.2 DHAV 基因组编码区  15-17
  1.4 鸭甲肝病毒的流行病学与发病机理  17-20
    1.4.1 宿主与流行情况  17-18
    1.4.2 临床症状与病理特征  18
    1.4.3 致病机理  18-19
    1.4.4 DHAV 在感染雏鸭体内的分布规律研究进展  19-20
  1.5 鸭甲肝病毒的检测技术研究进展  20-25
    1.5.1 病原学检测  20-21
    1.5.2 血清学检测  21-23
    1.5.3 分子生物学诊断方法  23-25
  1.6 DHAV 的防治  25
  1.7 本研究的目的与意义  25-26
2 材料与方法  26-38
  2.1 材料  26-27
    2.1.1 毒（菌）株  26
    2.1.2 实验动物  26
    2.1.3 主要仪器  26
    2.1.4 主要试剂  26-27
  2.2 方法  27-38
    2.2.1 分别检测 DHAV-1 、DHAV-3 的实时荧光定量 RT-PCR 方法的建立  27-36
    2.2.2 1 型和 3 型鸭甲肝炎病毒在雏鸭体内动态分布规律研究  36-38
3 结果与分析  38-56
  3.1 分别检测 DHAV-1、DHAV-3 的实时荧光定量 RT-PCR 方法的建立  38-43
    3.1.1 标准品的制备  38
    3.1.2 反应条件的优化结果  38-39
    3.1.3 检测 DHAV-1、DHAV-3 实时荧光定量 RT-PCR 标准曲线的制作  39-41
    3.1.4 特异性检测结果  41
    3.1.5 重复性检测结果  41-42
    3.1.6 对人工感染及临床病料的检测结果  42-43
  3.2 1 型和 3 型鸭甲肝炎病毒在雏鸭体内动态分布规律研究  43-56
    3.2.1 人工感染雏鸭的临床表现及剖检变化  43-46
    3.2.2 DHAV-1 在雏鸭体内的动态分布规律  46-47
    3.2.3 DHAV-3 在雏鸭体内的动态分布规律  47-48
    3.2.4 雏鸭人工混合感染 DHAV-1、DHAV-3 与单独感染 DHAV-1 在雏鸭体内的动态分布比较  48-52
    3.2.5 雏鸭人工混合感染 DHAV-1、DHAV-3 与单独感染 DHAV-3 在雏鸭体内的动态分布比较  52-56
4 讨论  56-60
  4.1 DHAV-1 和 DHAV-3 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立  56-57
  4.2 DHAV-1 在雏鸭体内的动态分布规律  57-58
  4.3 DHAV-3 在雏鸭体内的动态分布规律  58
  4.4 DHAV-1 和 DHAV-3 混合感染与单独感染雏鸭后在体内的动态分布比较  58-60
5 结论  60-61
参考文献  61-67
附录  67-70
致谢  70-71
攻读硕士学位期间发表论文情况  71

鸭甲肝病毒1型和3型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其在雏鸭体内动态分布规律的研究

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