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鸭疫里默氏杆菌菌蜕疫苗制备方法的研究及免疫效果的评价

作　者: 董洪亮
导　师: 柴同杰
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: RA 菌蜕细胞穿透肽免疫保护
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

鸭疫里默氏杆菌病（俗称鸭传染性浆膜炎）是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的鸭、鹅、火鸡等禽类的一种高致病性、接触性传染病，是危害养鸭业的主要疫病之一。该病呈世界性流行，发病率和死亡率一般为10－30%，部分鸭场达95%以上。目前对于该病的治疗主要依靠疫苗和抗生素，但因RA血清型多，目前使用的单价灭活疫苗并不能有效防控该病，此外，随着RA对多种抗生素耐药性的增加以及食品安全问题，使用抗生素防控该病的弊端日益显现，因此，疫苗的研制新型疫苗成为该病防控的重点。细菌菌蜕(bacterial ghost，BG)是革兰氏阴性菌被噬菌体PhiX174的裂解基因E裂解后形成的完整细菌空壳。由于它具有完整的细菌表面抗原结构，所以它能直接作为疫苗使用。与传统的疫苗相比，菌蜕疫苗能诱导机体的产生更高水平的细胞和体液免疫，菌蜕的制备可以通过发酵的方式大量生产，制备的冻干疫苗可以在室温条件下长时间保存，因此，菌蜕的研究具有广阔的应用前景。本研究主要开展3方面的研究工作：1）溶菌质粒的改造菌蜕是革兰氏阴性菌在噬菌体Phix174的溶菌基因E的作用下形成的细菌空壳，通常由λpL/pR-cI857温控系统通过调控E基因的表达制备。本研究通过重叠PCR技术，将λpL/pR-cI857温控系统中λpR启动子的第2个操纵基因(OR2)的第9位碱基由T突变为C (T→C)。溶菌试验结果表明，突变后的λpL/pR-cI857系统在37℃时仍能稳定抑制基因E的表达，对大肠杆菌的溶菌率为99.9%。本研究通过对λpR启动子的改造，扩大了λpL/pR-cI857温控系统的温度调控范围，构建了溶菌盒（ΔcI857-E-rrnB），为菌蜕疫苗的研制提供了参考。2）RA菌蜕制备方法的研究本研究对3种菌蜕的制备方法进行了研究。第一种方法：为了构建能够在RA中起溶菌作用的溶菌质粒，选用大肠杆菌和RA的穿梭载体pCP29，将pCP29与本研究构建的ΔcI857-E-rrnB溶菌盒酶切后，连接转化大肠杆菌BW19851，构建pCP29-ΔcI857-E-rrnB溶菌质粒，将该质粒导入RA菌株CH3中，制备RA菌蜕；第二种方法：通过基因替换的方法，将本研究构建的ΔcI857-E-rrnB溶菌盒替换掉大肠杆菌DE17的luxS基因，通过将ΔcI857-E-rrnB溶菌盒整合到细菌的基因组来实现非质粒依赖型的菌蜕制备方法；第三种方法：利用细胞穿透肽MAP，直接作用于RA，制备RA菌蜕。通过对3种菌蜕制备方法的研究，结果发现，将构建好的溶菌质粒导入RA CH3后，未能起到溶菌作用，不能制备RA菌蜕。通过基因替换的方式将溶菌盒导入大肠杆菌DE17基因组后，也没有起到溶菌效果。最后利用MAP，成功制备RA菌蜕，MAP制备RA菌蜕的条件为：用含60μM MAP的Na2HPO4溶液，稀释RA菌体至OD600=0.4左右，21℃恒温培养作用1h，加庆大霉素终止反应，最后离心收集菌体，制备RA菌蜕疫苗。通过电镜观察，制备的RA菌蜕，表面膜结构保持完整，具有菌蜕所特有的空壳结构。3）RA菌蜕疫苗的免疫效果评价为了对MAP制备的菌蜕疫苗的免疫效果进行评价，本研究对利用细胞穿透肽MAP制备的RACH3株菌蜕疫苗，与传统的甲醛灭活苗的免疫效果进行对比。抗体水平检测结果表明，一免10天后CH3灭活苗组及CH3菌蜕组，抗体滴度可以达到1：400，CH3灭活苗（佐剂）组及CH3菌蜕（佐剂）组，抗体滴度可以达到1：800，二免10天后，CH3灭活苗组及CH3菌蜕组，抗体滴度可以达到1：1600，CH3灭活苗（佐剂）组及CH3菌蜕（佐剂）组，抗体滴度可以达到1：3200。细胞因子检测及淋巴细胞增殖实验结果表明，一免后，对照组与免疫组，差异不显著；二免后，免疫组与对照组相比，差异显著，且CH3菌蜕（佐剂）组>CH3灭活苗(佐剂)组> CH3灭活苗组> CH3菌蜕组。免疫保护实验结果表明，加佐剂菌蜕组与不加佐剂的菌蜕组的保护率均为100%，而加佐剂的甲醛灭活疫苗组与不加佐剂的甲醛灭活苗组的保护率分别为100%，75%，结果表明菌蜕组具有较高的保护率。综上所述，本研究制备的RA菌蜕疫苗在免疫保护性以及刺激机体产生体液免疫和细胞免疫水平上均优于传统灭活疫苗。本研究通过点突变技术，成功构建载体。通过对菌蜕制备方法的比较研究，成功利用细胞穿透肽MAP，制备了RA菌蜕。在动物免疫保护实验中，菌蜕疫苗比传统甲醛疫苗显示更高的免疫保护效果。本研究为研制RA新型疫苗提供了参考。

全文目录

符号说明  4-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1.前言  13-24
  1.1 RA 研究进展  13-15
    1.1.1 RA 概述  13-14
    1.1.2 RA 疫苗的研究  14-15
  1.2 细菌菌蜕研究进展  15-23
    1.2.1 菌蜕的形成  16-17
    1.2.2 菌蜕的应用  17-21
      1.2.2.1 菌蜕疫苗  17-18
      1.2.2.2 菌蜕疫苗与细胞免疫  18-19
      1.2.2.3 菌蜕疫苗与粘膜免疫  19
      1.2.2.4 菌蜕作为载体  19-21
      1.2.2.5 菌蜕作为佐剂  21
    1.2.3 展望  21-22
    1.2.4 本研究的设想  22-23
  1.3 细胞穿透肽的研究进展  23-24
    1.3.1 细胞膜穿透机制  23-24
    1.3.2 展望  24
2.材料  24-27
  2.1 菌株和载体  24
  2.2 工具酶与试剂  24-25
  2.3 培养基及缓冲液配置  25-26
  2.4 仪器  26-27
3.方法  27-41
  3.1 引物的设计  27-28
  3.2 溶菌盒的改造  28-30
    3.2.1 突变 PCR 产物 ΔcI857-rrnB 的扩增  28
    3.2.2 溶菌表达质粒的构建  28-29
    3.2.3 溶菌实验  29-30
  3.3 非质粒依赖型菌蜕制备方法研究  30-34
    3.3.1 PCR 扩增 luxS 基因同源臂序列  30
    3.3.2 PCR 扩增氯霉素（Cat）抗性片段  30
    3.3.3 pUC19-up-ΔcI857-E-rrnB 载体的构建  30-31
    3.3.4 pUC19-up-ΔcI857-E-rrnB-down 载体的构建  31
    3.3.5 pUC19-up-ΔcI857-E-rrnB-cat-down 载体的构建  31-33
    3.3.6 电转感受态的制备  33
    3.3.7 大肠杆菌(DE17) LuxS 基因的替换株的构建  33-34
    3.3.8 大肠杆菌(DE17) Luxs 基因替换株的溶菌效果验证  34
  3.4 质粒依赖型菌蜕制备方法研究  34-36
    3.4.1 pCP29-ΔcI857-E-rrnB 的构建  34-35
    3.4.2 大肠杆菌 BW19851(pCP29-ΔcI857-E-rrnB)溶菌效果验证  35
    3.4.3 RA CH3（pCP29-ΔcI857-E-rrnB）的构建  35-36
    3.4.4 验证 RA CH3（pCP29-ΔcI857-E-rrnB）的溶菌效果  36
  3.5 细胞穿透肽 MAP 制备 RA 菌蜕方法研究  36-38
    3.5.1 MAP 作用浓度的确定及细菌灭活效率的计算  36-37
    3.5.2 MAP 作用制备 CH3 菌蜕  37
    3.5.3 电镜观察 MAP 制备的 CH3 菌蜕  37-38
      3.5.3.1 菌体的收集及处理  37
      3.5.3.2 透射电镜（TEM）观察  37-38
  3.6 RA 菌蜕免疫效果评价  38-41
    3.6.1 RA 菌蜕疫苗的制备  38
    3.6.2 RA 甲醛灭活苗的制备  38
    3.6.3 疫苗的无菌检测  38
    3.6.4 免疫实验  38-39
    3.6.5 免疫效果评价  39-41
      3.6.5.1 抗体检测  39-40
      3.6.5.2 细胞因子检测  40-41
      3.6.5.3 淋巴细胞增殖试验  41
    3.6.6 攻毒保护试验  41
4.结果  41-63
  4.1 溶菌盒的改造及溶菌效果比较  41-45
    4.1.1 溶菌质粒 pUC19- ΔcI857-E-rrnB 的构建  41-43
    4.1.2 大肠杆菌溶菌动力学比较  43-44
    4.1.3 不同诱导温度对溶菌率的影响  44-45
  4.2 非质粒依赖型菌蜕制备方法结果  45-49
    4.2.1 luxS 同源臂基因及氯霉素基因的克隆  45
    4.2.2 缺失载体 pUC19-up-ΔcI857-E-rrnB-cat-down 的构建  45-46
    4.2.3 缺失载体 pUC19-up-ΔcI857-E-rrnB-cat-down 的酶切鉴定结果  46-47
    4.2.4 ΔcI857-E-rrnB 溶菌盒对大肠杆菌 DE17 株 luxS 基因的替换结果  47
    4.2.5 DE17 (ΔcI857-E-rrnB-cat)的抗性消除  47-48
    4.2.6 DE17 (ΔcI857-E-rrnB)溶菌结果  48-49
  4.3 质粒依赖型菌蜕制备方法结果  49-52
    4.3.1 溶菌质粒 pCP29-ΔcI857-E-rrnB 的构建  49-50
    4.3.2 BW19851pCP29-ΔcI857-E-rrnB 对大肠杆菌的溶菌效果  50-51
    4.3.3 pCP29-ΔcI857-E-rrnB 转化 RA CH3 株  51
    4.3.4 pCP29-ΔcI857-E-rrnB 对 RA CH3 株的溶菌效果检测  51-52
  4.4 利用细胞穿透肽 MAP 制备 RA 菌蜕结果  52-63
    4.4.1 确定 MAP 的作用浓度及计算细菌的灭活效率  52-53
    4.4.2 利用细胞穿透肽 MAP 制备 RA 菌蜕  53
    4.4.3 电镜观察结果  53-54
      4.4.3.1 透视电镜直接观察  53-54
      4.4.3.2 透视电镜超薄切片观察  54
    4.4.4 疫苗的制备及无菌检测  54
    4.4.5 疫苗免疫效果  54-61
      4.4.5.1 抗体水平检测  54-55
      4.4.5.2 细胞因子检测  55-58
      4.4.5.3 淋巴细胞增殖实验  58-61
    4.4.6 攻毒保护实验  61-63
5.讨论  63-67
6.结论  67-68
参考文献  68-76
致谢  76-77
攻读学位期间发表论文及奖励  77

鸭疫里默氏杆菌菌蜕疫苗制备方法的研究及免疫效果的评价

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