学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

兔病毒性出血症基因工程疫苗研究

作 者: 程英杰
导 师: 吴润
学 校: 甘肃农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 兔病毒性出血症病毒 VP60 衣壳蛋白 Th细胞表位 “自杀性”DNA疫苗
分类号: S858.291
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
下 载: 11次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
 

内容摘要


【目的】兔病毒性出血症(Rabbithemorrhagicdisease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus,RHDV)引起的一种急性、烈性、致死性传染病。同其他病毒防治一样,免疫接种仍然是预防和治疗RHD的主要措施。由于至今没有获得RHDV稳定传代培养的细胞系,目前商品化的疫苗主要是组织灭活苗,其存在生物安全,污染物残留和动物福利等诸多弊端。本研究旨在利用分子生物学和基因工程技术,研发一种不但可以激发兔产生高水平的体液免疫应答,而且可诱导机体产生良好细胞免疫反应的新型基因工程疫苗。【方法】(1)通过融合PCR的方法扩增RHDVVP60优势抗原区A(31-250AA)和B(470-579AA)基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,使用IPTG诱导,使之表达AB-Th融合蛋白,为了评价该亚单位疫苗对动物的免疫效果,将纯化的AB-Th蛋白配以弗氏佐剂进行动物免疫试验,并以不携带通用Th细胞表位的AB蛋白和PBS为试验对照组,以ELISA检测血清RHDV特异性抗体变化,以MTT法检测其外周血淋巴细胞(PBL)的增殖反应活性,以干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)ELISA试剂盒检测体内细胞因子IFN-γ、IL-4水平,以攻毒保护试验评价其诱导的免疫反应抵抗强毒攻击的能力。(2)通过RT-PCR的方法扩增RHDV衣壳蛋白VP60,将其重组到甲病毒复制子载体pSCA1上,构建了包含RHDV衣壳蛋白VP60的重组复制子载体pSCA1/VP60,借助脂质体将纯化的重组质粒转染BHK-21细胞,通过RT-PCR法、Westernblot和间接免疫荧光(IFA)方法检测外源基因在细胞中的表达情况,为评价重组质粒作为DNA疫苗对动物的免疫效果,通过肌肉注射免疫试验兔,并以空载体pSCA1、PBS为试验对照组,以ELISA检测血清RHDV特异性抗体变化,以MTT法检测其外周血淋巴细胞(PBL)的增殖反应活性,以干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)ELISA试剂盒检测体内细胞因子IFN-γ、IL-4水平,以攻毒保护试验评价其诱导的免疫反应抵抗强毒攻击的能力。【结果】(1)成功表达了携带通用Th细胞表位的VP60优势抗原区的融合蛋白AB-Th,纯化后配以弗氏佐剂免疫试验兔,ELISA检测表明该融合蛋白在试验兔体内可诱导产生RHDV特异性抗体,淋巴细胞增殖和细胞因子检测表明该融合蛋白在试验兔体内可以诱导细胞免疫,与对照组相比,差异性显著(P<0.05),攻毒保护试验结果表明该亚单位疫苗可以抵抗RHDV强毒攻击,使动物获得免疫保护。(2)成功构建了包含RHDV衣壳蛋白VP60的重组复制子载体pSCA1/VP60,该重组质粒在BHK-21细胞中可以表达具有反应原性的RHDV衣壳蛋白,ELISA检测表明该重组质粒在试验兔体内可诱导产生RHDV特异性抗体,淋巴细胞增殖和细胞因子检测表明该重组质粒在试验兔体内可以诱导细胞免疫,与对照组相比,差异性显著(P<0.05),攻毒保护试验结果表明该DNA疫苗可以抵抗RHDV强毒攻击,使动物获得免疫保护。【结论】成功构建了一种基于兔病毒性出血症衣壳蛋白优势抗原区域的亚单位基因工程疫苗和一种“自杀性”DNA疫苗,均能有效激发试验兔产生良好的免疫应答,并保护动物对抗强毒的攻击。

全文目录


摘要  3-4
Summary  4-9
缩略词及符号说明  9-11
第一章 绪论  11-21
  1 基因工程疫苗的概述  11-15
    1.1 基因工程亚单位疫苗  11-13
      1.1.1 大肠杆菌表达系统  12
      1.1.2 酵母表达系统  12-13
      1.1.3 昆虫细胞表达系统  13
      1.1.4 哺乳动物细胞表达系统  13
    1.2 基因工程活载体疫苗  13-14
    1.3 核酸疫苗  14-15
      1.3.1 核酸疫苗的发展简史  14
      1.3.2 核酸疫苗的特点  14
      1.3.3 免疫原理  14-15
      1.3.4 研究现状  15
      1.3.5 未来展望  15
  2 兔瘟基因工程疫苗的研究现状与展望  15-18
    2.1 研究现状  15-17
      2.1.1 亚单位疫苗  16-17
      2.1.2 重组病毒活载体疫苗  17
    2.2 存在的问题及展望  17-18
  3 新型核酸疫苗—“自杀性”DNA疫苗的研究  18-20
    3.1 “自杀性”DNA疫苗的构建  18-19
      3.1.1 “自主复制型”RNA复制子载体  18
      3.1.2 “自杀性”DNA疫苗构建  18-19
    3.2 自杀性疫苗诱导细胞凋亡的机理  19
    3.3 自杀性疫苗的优点  19
    3.4 自杀性疫苗的存在的问题和展望  19-20
  4 研究目的和意义  20
  5 研究内容和方法  20-21
第二章 兔病毒性出血症亚单位疫苗研究  21-29
  1 材料和方法  21-24
    1.1 试验材料  21
      1.1.1 菌株与质粒  21
      1.1.2 主要试剂  21
    1.2 方法  21-24
      1.2.1 AB、AB-Th基因扩增  21-23
      1.2.2 重组表达质粒pET-30a/AB-Th和pET-30a/AB的构建与鉴定  23
      1.2.3 重组蛋白AB-Th、AB的诱导表达及纯化  23
      1.2.4 实验动物免疫  23
      1.2.5 RHDV特异性抗体的检测  23
      1.2.6 兔淋巴细胞增殖试验  23-24
      1.2.7 兔干扰素-γ(IFN-γ)ELISA检测  24
      1.2.8 兔白介素-4(IL-4)ELISA检测  24
      1.2.9 攻毒保护试验  24
  2 结果  24-28
    2.1 重组表达质粒的鉴定  24-25
    2.2 重组蛋白AB、AB-Th的诱导表达和纯化  25-26
    2.3 RHDV特异性抗体产生  26
    2.4 淋巴细胞增殖试验  26-27
    2.5 干扰素-γ(IFN-γ)  27
    2.6 白介素-4(IL-4)ELISA检测结果  27
    2.7 动物保护试验结果  27-28
  3 讨论  28-29
第三章 兔病毒性出血症“自杀性”DNA疫苗研究  29-37
  1 材料与方法  29-33
    1.1 材料  29-30
      1.1.1 菌株与质粒  29
      1.1.2 主要试剂  29
      1.1.3 主要仪器  29-30
    1.2 方法  30-33
      1.2.1 RHDV病毒总RNA的提取  30
      1.2.2 RNA的反转录  30
      1.2.3 引物的设计与合成  30
      1.2.4 重组质粒的构建  30-31
      1.2.5 VP60基因在BHK-21细胞中的表达  31-32
      1.2.6 实验动物免疫  32
      1.2.7 RHDV特异性抗体的检测  32
      1.2.8 兔淋巴细胞增殖试验  32
      1.2.9 兔干扰素-γ(IFN-γ)ELISA检测  32
      1.2.10 兔白介素-4(IL-4)ELISA检测  32-33
      1.2.11 攻毒保护试验  33
  2 结果与分析  33-36
    2.1 重组质粒的鉴定  33
    2.2 VP60 基因在BHK-21 细胞中的表达  33-34
    2.3 RHDV特异性抗体产生  34-35
    2.4 淋巴细胞增殖试验  35
    2.5 干扰素-γ(IFN-γ)  35
    2.6 白介素-4(IL-4)ELISA检测  35-36
    2.7 动物保护试验结果  36
  3 讨论  36-37
结论  37-38
致谢  38-40
参考文献  40-44
作者简介  44-45
导师简介  45-46

相似论文

  1. RNA聚合酶Ⅱ介导的FCV反向遗传操作系统的建立及RHDV VP60基因的表达,S852.65
  2. 人肠道病毒71型衣壳蛋白VP1、VP2、VP3、VP4的构建、表达及抗原性研究,R373
  3. 兔出血症病毒的单克隆抗体研制及其检测方法的建立,S858.291
  4. 兔出血症病毒基于质粒的感染性克隆构建及其结构蛋白VP10和VP60相互作用研究,S852.653
  5. 斑点叉尾鮰病毒(CCV)ORF6基因“自杀性”DNA疫苗的构建与免疫效果研究,R392.1
  6. 牛副流感病毒3型山东分离株核衣壳蛋白表达鉴定、多抗制备及应用,S852.65
  7. 犬瘟热病毒H基因克隆分析及DNA疫苗研究,S852.5
  8. 江苏地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及其病原核衣壳蛋白的原核表达,S852.65
  9. 猪圆环病毒2型单克隆抗体的研制和基于单抗的检测PCV2抗原的免疫组化法的建立及其初步应用,S854.43
  10. 抗新城疫病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的研制及特性研究,S852.65
  11. 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其N蛋白卵黄抗体的制备与鉴定,S852.5
  12. 欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达与单克隆抗体的研制,S852.65
  13. 人类杯状病毒的pET-28a(+)-SVA构建及高效表达和LAMP法检测,R373
  14. ats1A启动子驱动的兔出血症病毒外壳蛋白VP60基因的植物表达载体构建及百脉根的转化,Q943.2
  15. 猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备,S852.65
  16. 与PRRSV核衣壳蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选与验证,S852.65
  17. 禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的原核表达及T细胞表位筛选,S852.65
  18. 兔出血症病毒衣壳蛋白缺失株的拯救及其复制特性的研究,S852.65
  19. 鸡传染性支气管炎病毒核衣壳(N)蛋白的原核表达及其抗原性分析,S852.65
  20. 兔出血症病毒VP60蛋白与膜突蛋白相互作用的鉴定,S852.65
  21. 日本血吸虫鞘脂激活蛋白原T细胞免疫原性及功能研究,R392

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 >
© 2012 www.xueweilunwen.com