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合肥市宠物犬与犬粮携带沙门氏菌情况调查及耐药性研究
作 者: 王元兰
导 师: 李郁
学 校: 安徽农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 宠物犬 犬粮 沙门氏菌 耐药性 耐药基因 荧光定量PCR
分类号: S858.292
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
沙门氏菌(Salmonella)是一种重要的人畜共患病原菌,广泛地存在于人类、畜禽、宠物、各种食物等。宠物犬误食被沙门氏菌污染的饲料后而引起感染,在与人类密切接触的过程中,易将沙门氏菌传染给人类。同时,人类在喂食犬时,也可以因直接接触被污染的饲料而感染沙门氏菌,从而不断扩大沙门氏菌的传播范围。宠物犬和犬粮作为沙门氏菌的贮藏宿主,在沙门氏菌的散播及其对人类的影响方面扮演着重要的角色。为了解合肥市宠物犬和犬粮携带沙门氏菌情况,分离菌株的药物敏感性和耐药基因携带情况,及耐药基因mRNA的表达水平,本研究采集746份宠物犬肛棉拭子和404份犬粮样品,利用PCR与常规技术相结合的方法进行沙门氏菌的分离鉴定,分别采用凝集实验和K-B纸片扩散法确定分离菌株的血清型和耐药表型,用PCR方法检测耐药基因,同时结合表型确证实验鉴定产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株;利用SYBR Green I染料法建立flor基因和sul2基因实时荧光定量PCR(Real Time PCR)检测方法,并用Real Time PCR方法分别对不同菌株flor基因和sul2基因的mRNA表达量进行测定和分析。结果显示,宠物犬犬肛棉拭子样品中共分离沙门氏菌19株,阳性率为2.55%(19/746),肠炎沙门氏菌为优势血清型;犬粮样品中分离沙门氏菌10株,阳性率为2.48%(10/404),德尔卑沙门氏菌为主要的优势血清型。在对20种抗生素的感受性试验中,29株沙门氏菌对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林耐药性最强,而对头孢西丁和磷霉素最敏感。具有多重耐药性的菌株占分离菌株的31.03%,多重耐药谱为AMC-AMP-SXT-DOX。共检测出16种耐药基因,其中以strA-B基因的检出率最高,检出率为37.93%;其次是blaPSE基因,检出率为34.48%。结合表型确证试验,鉴定出6株产ESBLs菌株。成功建立了flor基因和sul2基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,最低检测限度分别为102copies/μL和103copies/μL。对氟苯尼考耐药的菌株S8、S10、G8、G17、G19的flor基因表达水平均高于中敏菌株S7;对复方新诺明耐药的菌株S10、G8、G17、G19的sul2基因表达水平均高于敏感菌株G6和G15。本研究表明,合肥市宠物犬和犬粮中不同程度的携带沙门氏菌,分离菌株耐药性严重,且出现了产ESBLs菌株;建立的荧光定量PCR方法重复性好,特异性高,具有快速、灵敏的特点,可替代普通PCR方法来进行耐药基因的检测;耐药基因的转录表达与耐药水平呈正相关。
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全文目录
中文摘要 4-5 Abstract 5-11 主要符号列表 11-12 文献综述 12-25 1 引言 25-26 2 材料与方法 26-41 2.1 材料 26-32 2.1.1 样品来源 26-28 2.1.2 质控菌株 28 2.1.3 主要增菌培养基 28 2.1.4 主要试剂 28 2.1.5 抗生素药敏试验纸片 28-29 2.1.6 所用引物序列 29-31 2.1.7 主要仪器 31-32 2.2 方法 32-41 2.2.1 沙门氏菌的分离培养 32-33 2.2.2 沙门氏菌分离株的 PCR 鉴定 33-34 2.2.3 沙门氏菌分离株的血清学试验 34 2.2.4 沙门氏菌分离株的药敏试验 34 2.2.5 沙门氏菌分离株的耐药基因检测 34-35 2.2.6 产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株表型筛选与确证试验 35-36 2.2.7 flor 基因和 sul2 基因荧光定量 PCR 检测方法的建立 36-39 2.2.8 菌株 flor 基因和 sul2 基因 mRNA 的表达水平 39-41 3 结果与分析 41-59 3.1 合肥市宠物犬携带沙门氏菌情况 41-42 3.2 合肥市犬粮污染沙门氏菌情况 42-43 3.3 29 株沙门氏菌分离株的药物感受性情况 43-44 3.4 10 株耐药沙门氏菌的多重耐药谱 44-45 3.5 29 株沙门氏菌分离株耐药基因检出结果 45-48 3.6 产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株试验 48-51 3.6.1 表型确证试验结果 48-49 3.6.2 测序结果 49-51 3.7 flor 基因和 sul2 基因荧光定量 PCR 检测方法的建立 51-56 3.7.1 普通 PCR 扩增产物和纯化电泳结果 51-52 3.7.2 重组质粒的 PCR 鉴定及测序比对 52 3.7.3 重组质粒拷贝数 52 3.7.4 荧光 PCR 引物扩增目的片段的验证 52-53 3.7.5 实时荧光定量 PCR 条件的优化 53 3.7.6 标准曲线的绘制 53-54 3.7.7 熔解曲线分析 54 3.7.8 敏感性试验 54-55 3.7.9 重复性试验 55-56 3.7.10 特异性试验 56 3.8 沙门氏菌分离株 flor 基因和 sul2 基因 mRNA 的表达水平 56-59 3.8.1 体外生长曲线 56-57 3.8.2 flor 基因和 sul2 基因 mRNA 的表达量 57-59 4 讨论 59-64 4.1 合肥市宠物犬携带沙门氏菌状况分析 59-60 4.2 合肥市犬粮污染沙门氏菌状况分析 60-61 4.3 沙门氏菌分离株的耐药性分析 61-62 4.4 耐药基因 flor 和 sul2 荧光定量 PCR 方法的建立及 mRNA 表达水平分析 62-64 结论 64-65 参考文献 65-80 致谢 80-81 作者简介 81 在读期间发表的论文 81
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 犬
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