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噬菌体及其裂解酶对奶牛乳腺炎的治疗效果研究

作　者: 杨毓
导　师: 马德顺
学　校: 沈阳大学
专　业: 动物学
关键词: 噬菌体 裂解酶 生物学特性 奶牛乳腺炎治疗
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


奶牛乳腺炎是现今奶牛养殖业中极易爆发的一种多发性疾病，严重影响产奶量和牛奶的品质，给养殖业造成了巨大的经济损失，为了寻找更加快速有效的治疗办法，本研究通过利用多株噬菌体制成的混合制剂来治疗牛乳腺炎，对治疗方法做了如下的尝试：1、采样，收集未处理过的环境污水样本，以从患病奶牛取得的奶样中分离的细菌作为指示菌，分离出多株噬菌体，其中两株裂解性噬菌体IME-SA1、IME-SA2能裂解多株金黄色葡萄球菌，属于比较广谱的噬菌体，存在着潜在的应用价值。2、鉴定，利用酶切片段并克隆测序后，在NCBI进行BLAST进行噬菌体种属鉴定；针对生物学特性的研究显示：噬菌体IME-SA1、IME-SA2的最佳感染复数均为0.01；噬菌体的侵染过程中，裂解期为30min，进入平稳期后滴度没有明显的变化。3、分析，将已分离的金黄色葡萄球菌噬菌体IME-SA1、IME-SA2进行Ion Torrent高通量测序，序列拼接，并进行了注释。在对IME-SA2的序列分析中，发现反向序列有3个高频序列，推测金黄色葡萄球菌噬菌体IME-SA2的末端特点：一端固定，另一端随机，且有一定冗余。4、扩增，利用原核表达载体pCold成功的在感受态细胞BM M15中表达了噬菌体IME-SA1的裂解酶LySA1。通过比浊法检测其有很好的活性。5、效果测定，检测裂解性噬菌体IME-SA1、IME-SA2常温下的杀菌效果发现宿主菌数量明显下降，表明噬菌体有很好的杀菌效果。6、临床试用，将制备好的噬菌体混合制剂用于河北文稷奶牛场患急性乳腺炎的乳牛治疗，实验乳牛都没有经过抗生素或其他药物治疗，经噬菌体治疗后症状均有好转，奶汁恢复到正常标准，红肿消退，达到治疗目的。噬菌体制剂用于治疗细菌性感染具有广阔的发展空间，可以预见，当人们把研制抗菌药物的注意力转至噬菌体上时，无疑是医学上的一个重大突破，也对于挽救危重感染病人的生命具有十分重要的意义。

全文目录


论文摘要  8-9
Abstract  9-10
缩略词表  10-11
1 绪论  11-21
  1.1 奶牛乳腺炎中常见病原菌  11-13
    1.1.1 大肠杆菌  11-12
    1.1.2 金黄色葡萄球菌  12-13
  1.2 目前常用的牛乳腺炎治疗方法  13-15
    1.2.1 常用的治疗方法及存在的问题  13-14
    1.2.2 针对治疗中的耐药菌采取的策略  14-15
  1.3 噬菌体及其裂解酶  15-18
    1.3.1 噬菌体及其治疗  15-17
    1.3.2 裂解酶及其治疗  17-18
  1.4 噬菌体的全基因组测序分析  18-19
  1.5 噬菌体治疗牛乳腺炎的意义  19-21
2 材料与方法  21-39
  2.1 试验材料  21-24
    2.1.1 供试菌株  21
    2.1.2 培养基  21
    2.1.3 实验设备和材料  21-24
  2.2 试验方法及步骤  24-39
    2.2.1 菌株鉴定  24-25
    2.2.2 噬菌体的分离  25-26
    2.2.3 哩菌体的生物学特性研究  26-27
    2.2.4 噬菌体的鉴定  27-31
    2.2.5 噬菌体裂解酶LySAl的表达及纯化  31-35
    2.2.6 混合试剂的治疗  35-39
3 结果与分析  39-71
  3.1 菌株鉴定  39-42
    3.1.1 大肠杆菌的菌株鉴定  39-40
    3.1.2 金黄色葡萄球菌的菌株鉴定  40-42
  3.2 唾菌体的分离  42
  3.3 唾菌体的生物学特性研究  42-47
    3.3.1 噬菌体裂解谱测定  42-45
    3.3.2 噬菌体最佳感染复数  45-46
    3.3.3 一步生长曲线  46-47
  3.4 喷菌体的鉴定  47-56
    3.4.1 噬菌体的基因组鉴定  47-48
    3.4.2 噬菌体的种属鉴定  48-50
    3.4.3 噬菌体负染色图片  50-51
    3.4.4 噬菌体全基因组Ion Torrent测序结果及其生物信息学分析  51-56
  3.5 噬菌体IME-SA1裂解酶LYSA1的表达  56-60
    3.5.1 质粒的构建  56-58
    3.5.2 蛋白的表达  58-59
    3.5.3 裂解酶LySAl活性检测  59-60
  3.6 混合制剂的治疗效果  60-67
    3.6.1 预实验结果  60-64
    3.6.2 牛乳腺炎治疗效果  64-67
  3.7 讨论  67-71
    3.7.1 噬菌体治疗的可行性  67-68
    3.7.2 从环境样本中高效分离噬菌体  68
    3.7.3 选择安全溶剂  68-69
    3.7.4 噬菌体制剂的保存  69
    3.7.5 对分离得到的噬菌体进行鉴定的必要性  69-71
4 结论  71-73
参考文献  73-79
在学期间研究成果  79-81
致谢  81-82

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 牛
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