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猪链球菌2型relSs基因和perR基因功能的研究
作 者: 张腾飞
导 师: 周锐
学 校: 华中农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌2型(SS2) relSs基因 (p)ppGpp 严谨反应 葡萄糖饥饿 表达谱芯片 perR基因 氧化应激应答 dpr基因 metQIN操纵子
分类号: S858.28
类 型: 博士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
猪链球菌是一个经济上非常重要的革兰氏阳性兼性厌氧细菌,能够引起猪甚至是人类的一些严重的疾病。作为一个动物源的病原菌,猪链球菌2型(SS2)在越南和香港已经成为成人脑炎的重要病原。1998年和2005年,中国爆发了2次大规模的人类感染,导致229人感染,52人死亡。和其它的病原菌一样,在感染时,猪链球菌也会遭受各种环境压力,如营养不足、铁限制和氧化压力。在本实验室之前的研究中,我们发现猪链球菌2型perR和relSs基因在模拟铁限制的条件下发生了差异表达,说明它们在感染时对压力环境的适应起了一定的作用。在此,我们对猪链球菌2型perR和relSs基因的功能和其在转录调控上的作用进行了进一步的研究。1.猪链球菌2型relSs基因功能的研究严谨反应是在细菌在遭受环境压力和营养不足时,由RelA/SpoT催化合成信号分子(p)ppGpp,诱导细菌产生的一系列适应性反应。经典的严谨反应是由氨基酸饥饿引起核糖体在合成蛋白质时发生空转反应,RelA通过与核糖体的相互作用感受氨基酸饥饿,合成信号分子(p)ppGpp,从而引发细菌的适应性调控。然而,对于其它环境和营养变化下发生的严谨反应则研究较少。在SS2的基因组中我们发现了RelA/SpoT同源蛋白Relss和具有(p)ppGpp合成功能域的小片段酶RelQ。前期本实验室的研究发现铁限制条件下能诱导SS2relSs基因表达上调。本研究我们进一步发现在SS2中不仅在氨基酸饥饿时,而且在铁限制和葡萄糖饥饿时也能诱发SS2中胞内信号分子(p)ppGpp的积累,Relss是葡萄糖饥饿时合成(p)ppGpp唯一的酶,而Relss和RelQ则共同参与氨基酸饥饿和铁限制条件下的严谨反应。进一步通过比较△relSs及其亲本菌株SC-19在葡萄糖饥饿时的全基因表达谱,我们深入研究了葡萄糖饥饿诱发的严谨反应调控,发现RelSs不仅介导经典的严谨反应,例如抑制DNA复制和蛋白质合成,而且还能通过抑制糖酵解相关酶基因的表达,激活了“碳代谢产物阻遏系统”,以其他碳源代替葡萄糖来维持SS2的生存。这些结果较为完整地解析了由Relss所介导的葡萄糖饥饿时SS2的适应性调控,初步揭示了葡萄糖饥饿诱发严谨反应的机制,为研究细菌,特别是革兰氏阳性菌由碳饥饿诱导的严谨反应奠定了基础。此外,动物试验结果表明△relSs对小鼠的致病性明显减弱。2.猪链球菌2型perR基因功能的研究金属离子是细胞代谢重要的微量营养元素,但是过多的铁离子以及锌离子会引起对细胞有害的活性氧生成。Fur家族的蛋白Fur、Zur和PerR则分别调控着细胞内的铁、锌离子的摄取以及氧化应激的应答。然而不同于其他革兰氏阳性细菌,猪链球菌中只有一个Fur家族蛋白(本文注释为PerR),以前的研究发现它调控细菌对锌和铁的摄取。在本研究中,我们通过构建SS2SC-19菌株的perR缺失突变菌株△perR,发现PerR还调控了细菌的氧化应激应答。通过荧光定量RT-PCR和电泳迁移率实验(EMSA),我们鉴定了2个直接受PerR调控的基因或操纵子dpr和metQIN。dpr基因编码一个Dps家族的氧化抵抗蛋白,缺失dpr使得菌株(△dpr和△dprAperR)对H202高度敏感。MetQIN则是一个甲硫氨酸转运系统,实验发现在AperR中,甲硫氨酸的利用增加,并且间接影响了细菌对过氧化物的耐受。使用启动子-绿色荧光蛋白基因融合的报告系统,我们发现PerR的调节子能够被H202诱导,而且这个诱导受到金属离子的影响。动物试验结果表明,perR缺失菌株的致病性减弱,而且更加容易从感染小鼠体内清除。这些结果有力地证明了在SS2中,除了能够调控铁离子和锌离子的利用之外,PerR还能通过调控Dpr和MetQIN来实现对氧化应激的调控作用。
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全文目录
目录 4-6 摘要 6-8 Abstract 8-10 缩略语表 10-12 第一章 文献综述 12-33 1.1 猪链球菌概述 12-13 1.2 细菌对环境的适应 13-14 1.3 严谨反应 14-23 1.3.1 (p)ppGpp的代谢 14-16 1.3.2 (p)ppGpp与转录调控 16-19 1.3.3 (p)ppGpp与翻译调控 19-20 1.3.4 (p)ppGpp抑制DNA复制 20 1.3.5 (p)ppGpp对细菌其他生理上表型的影响 20-23 1.4 Fur家族蛋白 23-33 1.4.1 Fur家族概述 23-25 1.4.2 Fur家族蛋白研究进展 25-33 第二章 猪链球菌2型rel_(Ss)基因功能的研究 33-74 摘要 33-34 2.1 材料和方法 34-48 2.1.1 菌株与质粒 34-35 2.1.2 实验相关试剂 35-39 2.1.3 重组质粒的构建 39-41 2.1.4 猪链球菌rel_(Ss)缺失突变菌株的构建与鉴定 41-43 2.1.5 营养限制条件下生长曲线的测量 43 2.1.6 细菌体内~(32)P标记的(p)ppGpp的检测 43-44 2.1.7 体外检测重组蛋白的(p)ppGpp合成活性 44-45 2.1.8 细菌双杂交技术 45 2.1.9 细菌总RNA的提取 45-46 2.1.10 芯片杂交与扫描 46 2.1.11 数据分析 46 2.1.12 荧光定量PCR验证芯片结果 46-47 2.1.13 动物实验 47-48 2.2 结果与分析 48-69 2.2.1 rel_(Ss)突变菌株的构建与鉴定 48-51 2.2.2 营养限制条件下的生长情况 51-52 2.2.3 营养限制条件下(p)ppGpp的积累 52-53 2.2.4 体外鉴定RelQ活性 53-54 2.2.5 Rel_(Ss)和RelQ与ACP的相互作用 54-55 2.2.6 葡萄糖对SC-19和△rel_(Ss)基因表达谱的影响 55-57 2.2.7 芯片结果的荧光定量RT-PCR验证 57-58 2.2.8 SS2典型的依赖(p)ppGpp的严谨反应 58-60 2.2.9 糖类转运 60-62 2.2.10 糖酵解和脂肪酸合成的调控 62-66 2.2.11 CCR系统介导的碳代谢调控的作用 66-68 2.2.12 CodY调控 68-69 2.2.13 小鼠的致病性实验 69 2.3 讨论 69-74 2.3.1 不同条件下(p)ppGpp的积累 69-70 2.3.2 典型的严谨反应与细菌生长 70-71 2.3.3 Rel_(Ss)调控糖酵解从而影响CCR系统的调控 71-72 2.3.4 CodY调控 72 2.3.5 Rel_(Ss)表达调控的小结 72-73 2.3.6 Rel_(Ss)对致病性的影响 73-74 第三章 猪链球菌2型转录调控因子PerR功能的研究 74-101 摘要 74-75 3.1 材料和方法 75-84 3.1.1 菌株与质粒 75-77 3.1.2 实验相关试剂 77-78 3.1.3 perR基因突变菌株和互补菌株的构建 78 3.1.4 菌株的过氧化氢敏感性分析 78-79 3.1.5 相对荧光定量检测基因表达水平改变 79-81 3.1.6 重组蛋白的表达纯化与凝胶迁移率实验 81-82 3.1.7 氨基酸利用的检测 82 3.1.8 启动子-EGFP报告系统的构建 82-83 3.1.9 启动子-EGFP报告系统的表达调控 83 3.1.10 小鼠致病性实验 83-84 3.2 结果与分析 84-97 3.2.1 链球菌中Fur家族蛋白的鉴定 84-85 3.2.2 perR缺失突变菌株和互补菌株的构建与鉴定 85-87 3.2.3 PerR对过氧化氢敏感性的影响 87-88 3.2.4 PerR直接调控基因的鉴定 88-91 3.2.5 Dpr对H_2O_2耐受的影响 91 3.2.6 MetQIN对H_2O_2耐受的影响 91-93 3.2.7 H202和金属离子对PerR调控的影响 93-95 3.2.8 PerR对细菌致病性与宿主体内生存能力的影响 95-97 3.3 讨论 97-101 3.3.1 PerR蛋白在猪链球菌中的作用 97 3.3.2 S suis中PerR的调控子 97-99 3.3.3 PerR调控小结 99-100 3.3.4 PerR对致病性和宿主体内生存的作用 100-101 结论与展望 101-102 参考文献 102-113 附表 113-164 论文发表 164-165 致谢 165
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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