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隐孢子虫LAMP检测方法的建立与应用

作　者: 史亚东
导　师: 菅复春
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 隐孢子虫环介导等温扩增聚合酶链式反应检测染色
分类号: S855.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是由隐孢子虫(Cryptosporidium)引起的一种重要的人兽共患寄生虫病,可以引起人及哺乳类、鸟类、鱼类、爬行类等动物出现腹泻或消化道症状,对于免疫缺陷或抑制病人危害更严重,甚至危及生命。随着工业化和城市化的快速进行,环境污染越来越严重,含有隐孢子虫卵囊的动物或人的粪便污染食物或饮水,存在人或动物感染隐孢子虫的风险,因此需要更适合的检测方法对动物粪便或环境样本进行检测。本研究的目的就在于建立一种简单、快速、特异性好、灵敏度高的分子生物学方法来检测粪便中的隐孢子虫。本研究根据微小隐孢子虫18S rRNA基因的4条特异LAMP引物设计2条环引物,初步建立并优化了LAMP(环介导等温扩增)方法来快速检测微小隐孢子虫。结果发现,LAMP反应过程可省去95℃热变性和80℃酶失活过程,最佳反应温度和时间分别是63℃和60min, MgSO4、Betaine、dNTP Mixure、Bst DNA聚合酶的最佳浓度分别是0.8moI/L、0.8mmol/L、8U/25μL,外内引物最浓度分别为1.2μmol/L,添加环引物后LAMP反应时间缩短为20min。该方法展现了较好的特异性,检测微小隐孢子虫出现LAMP特征性梯状条带,对贾第虫、肠阿米巴、柔嫩艾美耳球虫、类圆线虫检测则无特征性梯状条带；LAMP的检测限度为5×100个/μL,比常规PCR方法的检测限度低2个数量级(100倍);LAMP产物经酶切验证得到预期的结果。比较LAMP产物在3个不同浓度琼脂糖中电泳,发现在1.5%的琼脂糖中电泳时,LAMP条带较分散,比较容易观测；比较4种不同的LAMP结果判断方法,发现通过SYBR Green1显色来判断LAMP结果可用于现场快速检测。本研究对C.parvum、C.wrairi、C.muris、C. baileyi和C. serpentis的一些18s rRNA基因序列进行比对,得到保守片段,利用该保守片段设计LAMP引物,建立并优化了隐孢子虫属特异可视LAMP检测方法。LAMP反应体系优化结果为：最佳反应温度和时间分别为63℃和60min, MgSO4、dNTP Mixture、Betaie、Bst DNA聚合酶的最佳浓度分别是8mmol/L、1.0mmol/L、0.8mol/L、8U/25μL,外内引物最浓度分别为0.2μmol/L、1.6μmol/L,添加环引物后LAMP反应时间缩短为20min。建立的LAMP方法检测微小隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、鼠隐孢子虫、安氏隐孢子虫、隐孢子虫禽基因型V出现LAMP特征性梯状条带,经SYBR Green I显色为(亮)绿色,而贾第虫、肠阿米巴、柔嫩艾美尔球虫、类圆线虫及双蒸水无特征性梯状条带,经SYBR Green I显色为橙色；LAMP的检测限度是5×101个卵囊/μL,比常规PCR方法的检测限度低1个数量级(10倍)；LAMP产物经酶切验证得到了预期的结果。本研究对SYBR Green I的使用做了系统详细的优化,发现该染料的最佳使用浓度是1000×,最佳使用量是1μL,最佳观测方法是可见光直接肉眼观测,我们还创新了一种染料添加方法,可以不开盖进行显色反应,该方法经济、实用,非常适合于LAMP结果的可视判断;LAMP产物经SYBR Green I显色的检测限度和电泳检测限度相似。对实验室保存的样本进行检测也验证了该方法的可行性,该方法的检测敏感性和巢式PCR方法的相似。

全文目录

致谢  5-9
摘要  9-11
文献综述  11-27
  引言  11
  1 隐孢子虫概况  11-13
    1.1 生物学分类和生物学特征  11-12
    1.2 流行病学及致病性  12
    1.3 感染途径及宿主特异性  12
    1.4 隐孢子虫病的诊断与治疗  12-13
  2 环介导等温核酸扩增技术(LAMP)  13-27
    2.1 LAMP技术基本介绍  13-15
    2.2 LAMP结果判断方法  15-20
    2.3 LAMP在寄生虫检测上的应用情况  20-24
    2.4 LAMP检测隐孢子虫研究进展  24-25
    2.5 小结  25-27
第一部分微小隐孢子虫LAMP检测方法的条件优化  27-41
  引言  27
  1 材料与方法  27-34
    1.1 虫种  27
    1.2 主要试剂和仪器  27-28
    1.3 主要溶液的配制  28
    1.4 DNA的提取  28-29
    1.5 引物设计选择及合成  29
    1.6 LAMP反应和PCR反应体系的建立  29-32
    1.7 LAMP反应的优化  32-33
    1.8 LAMP特异性试验  33
    1.9 LAMP敏感性试验  33
    1.10 产物酶切试验  33
    1.11 LAMP产物的检测方法的比较  33-34
  2 结果与分析  34-38
    2.1 反应过程、时间、温度的优化结果  34
    2.2 反应体系优化结果  34-36
    2.3 环引物的效果  36
    2.4 敏感性试验结果与分析  36
    2.5 特异性试验结果与分析  36
    2.6 酶切后电泳结果与分析  36
    2.7 LAMP产物的检测方法比较结果  36-38
  3 小结与讨论  38-41
    3.1 LAMP反应体系的优化  38
    3.2 敏感性和特异性试验  38-39
    3.3 LAMP产物的检测方法比较  39
    3.4 小结  39-41
第二部分隐孢子虫属特异性可视LAMP检测方法的建立及初步应用  41-56
  引言  41
  1 材料与方法  41-45
    1.1 虫种  41
    1.2 主要试剂和仪器  41
    1.3 主要溶液的配制  41
    1.4 DNA的提取  41
    1.5 引物设计选择及合成  41-42
    1.6 LAMP反应和PCR反应建立  42-43
    1.7 LAMP反应的优化  43-44
    1.8 LAMP特异性试验  44
    1.9 LAMP敏感性试验  44
    1.10 产物酶切试验  44
    1.11 LAMP产物SYBR Green I显色检测方法的完善和创新  44-45
    1.12 隐孢子虫属特异性可视LAMP检测方法的应用  45
  2 结果与分析  45-53
    2.1 反应时间、温度的优化结果  45
    2.2 反应体系优化结果  45
    2.3 环引物的效果  45-47
    2.4 敏感性试验结果与分析  47-48
    2.5 特异性试验结果与分析  48
    2.6 酶切后电泳结果与分析  48
    2.7 LAMP产物SYBR Green I显色检测方法的创新  48-51
    2.8 隐孢子虫属特异性可视LAMP检测方法的应用  51-53
  3 小结与讨论  53-56
    3.1 靶基因的选择  53-54
    3.2 LAMP反应体系的优化  54
    3.3 敏感性和特异性试验  54
    3.4 LAMP产物酶切验证  54
    3.5 创新染料添加方法的可行性分析  54-55
    3.6 属特异性可视LAMP方法的检测效果  55
    3.7 小结  55-56
结论与创新点  56-57
参考文献  57-66
Abstract  66-68
个人简历  68

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