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鸭坦布苏病毒对小鼠的分子致病机制

作 者: 彭珊
导 师: 何文兴
学 校: 济南大学
专 业: 生物化工
关键词: 鸭坦布苏病毒 致病性 荧光定量PCR 嗅上皮
分类号: S855.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
下 载: 15次
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内容摘要


2010年4月,最先在我国南方地区爆发了一种以蛋鸭产蛋量急剧下降、采食量减少、生长迟缓甚至死亡为特征的新发病毒性疾病,给蛋鸭饲养业带来巨大的经济损失。几个实验室相继分离鉴定出引起该病的病原体。核苷酸序列分析表明该病原体为黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)恩塔亚病毒群(Ntaya virus group)的鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)。黄病毒属的其它大部分成员能够引起严重的人畜共患性传染病,因此,到目前为止我们尚不能排除DTMUV感染人类的可能性。为了研究DTMUV对哺乳动物的致病性,本研究以BABL/c小鼠为实验动物模型,以DTMUVFX2010株为代表株,将该病毒通过脑内直接接种方式传25代、然后经鼻腔接种继续传代至28代。通过比较FX2010、P7、P14、P21和P28对小鼠的致病性发现,FX2010鼻腔攻毒不感染小鼠,而P7、P14、P21和P28均能够通过鼻腔接种致死小鼠。为了进一步研究DTMUV与其传代毒株对小鼠和鸭的致病性,本研究根据DTMUV的E基因保守区域设计了特异反转录引物、核酸探针和扩增引物,建立了一种定量组织中的DTMUV含量的TaqMan荧光定量PCR方法。之后,分别选择不同攻毒剂量和不同攻毒方式进行致病性研究,结果发现,FX2010、P7和P28通过肌肉注射方式感染小鼠均不致死,也无任何明显症状;通过鼻腔接种小鼠其致病力却显著不同,103ELD50的P7和P28病毒能够致死小鼠,而105ELD50的FX2010不能使小鼠死亡。本研究应用荧光定量PCR技术进一步监测了FX2010、P7、P28病毒通过鼻腔接种小鼠后,在小鼠脏器内的增值情况,结果显示,FX2010、P7和P28都能在小鼠的鼻和肺内增殖,但前者病毒含量高于后者;三者都不感染小鼠的脾脏和肾脏;FX2010不能在小鼠的脑内复制,而P7和P28能够感染小鼠脑且病毒含量较高。鸭子实验证明,FX2010和P28都能引起鸭的全身性感染,它们对鸭的致病力差异不显著。通过对全基因组序列比较发现,FX2010与P7之间只有两个氨基酸位点突变(E蛋白上的E597K和NS3蛋白上的A2001T),FX2010和P28之间有12个核苷酸位点突变,导致6个氨基酸位点突变。结果表明E蛋白上的E597K和NS3蛋白上的A2001T在DTMUV对小鼠致病性增强中起到了关键作用。为研究DTMUV传代毒由鼻腔进入脑组织的扩散路径,本研究利用5%ZnSO4溶液,通过灌鼻破坏小鼠的嗅上皮,然后用P7病毒经鼻腔接种小鼠,实验结果显示,相对于对照组,破坏嗅上皮的小鼠死亡率明显降低,而且死亡时间延迟。本研究发现FX2010非常容易适应小鼠,E蛋白上的E597K和NS3蛋白上的A200-1T突变在DTMUV对小鼠的致病过程中发挥重要作用,同时发现DTMUV传代毒利用嗅上皮来通过鼻腔进入脑组织。

全文目录


目录  5-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章 绪论  12-26
  1.1 鸭坦布苏病毒概述  12
  1.2 鸭坦布苏病毒的病原学特性  12-13
    1.2.1 分类和理化性质  12-13
    1.2.2 血凝特性  13
    1.2.3 培养特性  13
  1.3 鸭坦布苏病毒的分子生物学特性  13-16
    1.3.1 基因组结构特点  13-14
    1.3.2 基因组编码产物及功能  14-16
  1.4 鸭坦布苏病毒的流行病学  16-17
  1.5 鸭坦布苏病毒的检测  17-20
    1.5.1 病毒分离鉴定  17
    1.5.2 血清学检测  17-18
    1.5.3 核酸检测方法  18-20
  1.6 鸭坦布苏病毒的防控  20
  1.7 实时荧光定量 PCR 技术概述  20-24
    1.7.1 实时荧光定量 PCR 技术原理  21
    1.7.2 实时荧光定量 PCR 技术中荧光标记方法的分类  21-24
  1.8 本文研究的目的及意义  24-26
第二章 鸭坦布苏病毒对小鼠的适应性研究  26-34
  2.1 材料  26-27
    2.1.1 病毒株、试验动物  26
    2.1.2 主要试剂  26
    2.1.3 主要仪器设备和器材  26-27
  2.2 方法  27-30
    2.2.1 DTMUV 在小鼠体内传代  27
    2.2.2 FX2010、P7、P14、P21、P28 基因组序列测定  27-30
    2.2.3 FX2010、P7、P14、P21、P28 对小鼠的致病力研究  30
  2.3 结果  30-32
    2.3.1 传代过程中小鼠的临床症状表现  30
    2.3.2 FX2010、P7、P14、P21、P28 的全基因序列比较  30-31
    2.3.3 致病力实验结果  31-32
  2.4 本章小结  32-34
第三章 鸭坦布苏病毒 TaqMan 荧光定量 PCR 方法的建立  34-40
  3.1 材料  34
    3.1.1 病毒株  34
    3.1.2 主要试剂及仪器  34
  3.2 方法  34-36
    3.2.1 探针与反转录特异性引物的设计  34-35
    3.2.2 RNA 的提取和反转录反应  35
    3.2.3 建立标准质粒 DNA 模板  35
    3.2.4 荧光定量 PCR 标准曲线的建立  35
    3.2.5 荧光定量 PCR 特异性试验  35-36
    3.2.6 荧光定量 PCR 敏感性试验  36
    3.2.7 荧光定量 PCR 重复性试验  36
    3.2.8 临床样品检测  36
  3.3 结果  36-39
    3.3.1 荧光定量 PCR 标准曲线  36-37
    3.3.2 荧光定量 PCR 特异性  37
    3.3.3 荧光定量 PCR 敏感性  37-38
    3.3.4 荧光定量 PCR 重复性  38
    3.3.5 临床样品检测结果  38-39
  3.4 本章小结  39-40
第四章 鸭坦布苏病毒与其传代毒株的致病性差异研究  40-50
  4.1 材料  40
    4.1.1 病毒株、试验动物  40
    4.1.2 主要试剂及仪器  40
  4.2 方法  40-42
    4.2.1 FX2010、P7、P28 对小鼠致病力研究  40-41
    4.2.2 间接 ELASA 抗体检测  41
    4.2.3 FX2010、P7、P28 在小鼠体内的增殖过程检测  41
    4.2.4 P28 对鸭子的敏感性实验  41-42
  4.3 结果  42-47
    4.3.1 FX2010、P7、P28 对小鼠致病力的研究结果  42-44
    4.3.2 间接 ELASA 抗体检测结果  44
    4.3.3 病毒在小鼠体内的增殖过程检测结果  44-46
    4.3.4 P28 对鸭子的敏感性实验结果  46-47
  4.4 本章小结  47-50
第五章 鸭坦布苏病毒传代毒由鼻腔进入脑组织的扩散路径研究  50-60
  5.1 材料  50-51
    5.1.1 病毒株、试验动物  50
    5.1.2 主要试剂及仪器  50-51
    5.1.3 主要溶液的配制  51
  5.2 方法  51-52
    5.2.1 5% ZnSO4溶液实验  51
    5.2.2 免疫组织化学观察  51-52
  5.3 结果  52-57
    5.3.1 5% ZnSO4溶液实验结果  52-54
    5.3.2 免疫组织化学观察结果  54-57
  5.4 本章小结  57-60
第六章 结论  60-62
参考文献  62-68
致谢  68-70
附录  70

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医传染病学 > 病毒病
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