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家兔精原干细胞分离培养与鉴定

作 者: 李莹
导 师: 李青旺
学 校: 西北农林科技大学
专 业: 动物学
关键词: 家兔 精原干细胞 培养 鉴定
分类号: S829.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
下 载: 21次
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内容摘要


精子发生是一个雄性动物终身产生大量精子的复杂过程,它包括增殖,分化以及生殖细胞的形成。精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells, SSCs)是精子发生的基础,且SSCs是雄性个体中唯一能够进行有丝分裂并把遗传信息传递给子代的干细胞而睾丸内的生殖细胞中仅有0.03%是生殖干细胞。2003年Kanatsu-Shinohara等人首次建立小鼠生殖干细胞体外长期培养系统,从刚出生的小鼠的睾丸中分离出生殖干细胞,并通过在体外长期培养获得了多能性生殖干细胞。然而同为啮齿类动物的家兔,其生殖干细胞体外长期培养系统的建立却鲜有报道。啮齿类动物精原干细胞移植技术是研究哺乳动物精子发生的一种重要的新工具,同时也为使用家畜精原干细胞进行家畜品种保育和转基因动物生产提供了研究基础。本研究为建立家兔精原干细胞体外培养体系和转基因兔的生产奠定了基础,有利于干细胞的培养及其生长条件的深入研究探索。本试验研究收集15-20d雄性家兔幼兔睾丸,通过对其进行机械法及两步酶消化法处理后获得家兔SSCs单细胞悬液;反复差速贴壁法进行SSCs的纯化,后接种于以支持细胞(Sertoli)为饲养层细胞的培养基;碱性磷酸酶染色(AKP),免疫细胞化学方法以及RT-PCR方法进行所培养细胞的鉴定;传代后使用DMSO和程序冷冻仪进行了家兔SSCs的冻存,供试验使用。试验结果如下:(1)试验收集15-20日龄雄性家兔幼兔睾丸,两步酶消化,分离得到纯度75%左右家兔SSCs,使用差速贴壁进行纯化效果佳。家兔睾丸Sertoli细胞作为饲养层,SSCs增殖快,3-4d即出现SSCs克隆。对所培养细胞传代,3代内仍保持细胞增殖能力,可为试验提供稳定材料。(2)将所培养细胞进行AKP染色后,细胞被染成蓝紫色,即AKP呈阳性,细胞具多能性,属于家兔精原干细胞。RT-PCR反应检测到了Oct4以及Ngn3基因的表达,具有生殖细胞特性及特定表面标记,既培养细胞是家兔精原干细胞。免疫细胞化学反应检测到有干细胞表面标记CD9的表达,再次确认培养细胞即为家兔精原干细胞。(3)家兔SSCs经过冻存和复苏后细胞活率最佳仍能保持到75%左右。本试验研究所建立家兔精原干细胞体外长期培养系统,对于精子发生机制、精原干细胞生长环境了解和精原干细胞移植的进行奠定了材料基础,也为探索更多家畜精原干细胞的分离培养提供了技术基础。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
第一章 精原干细胞的研究进展  11-22
  1.1 精原干细胞基本概况  11-13
    1.1.1 哺乳动物睾丸  11-12
    1.1.2 SSCs的起源  12
    1.1.3 SSCs的分类  12-13
  1.2 SSCs的生物学特征  13-16
    1.2.1 SSCs的表面分子标记  13-14
    1.2.2 SSCs巢(SSCs Niche)  14-15
    1.2.3 SSCs自我更新所包含的信号通路  15-16
  1.3 SSCs的增殖与分化及其体外培养  16-19
    1.3.1 SSCs的体内和体外增殖与分化  16-17
    1.3.2 SSCs体外培养研究进展  17-19
  1.4 SSCs的应用介绍  19-21
    1.4.1 SSCs在男性不育治疗中的应用  19-20
    1.4.2 SSCs在细胞治疗中的应用  20-21
    1.4.3 SSCs在家畜转基因生产中的应用  21
  1.5 本研究目的及意义  21-22
第二章 家兔精原干细胞体外分离培养  22-28
  前言  22
  2.1 材料与方法  22-25
    2.1.1 材料  22-24
    2.1.2 方法  24-25
  2.2 结果  25-26
    2.2.1 SSCs分离  25-26
    2.2.2 SSCs纯化  26
    2.2.3 SSCs形态  26
  2.3 讨论  26-27
  2.4 小结  27-28
第三章 培养家兔SSCs的鉴定  28-34
  前言  28
  3.1 材料与方法  28-31
    3.1.1 材料  28-29
    3.1.2 方法  29-31
  3.2 结果  31-32
    3.2.1 AKP染色结果  31
    3.2.2 RT-PCR结果  31-32
    3.2.3 免疫细胞化学染色结果  32
  3.3 讨论  32-33
  3.4 小结  33-34
第四章 家兔SSCs的冻存与复苏  34-38
  前言  34
  4.1 材料与方法  34-36
    4.1.1 试验材料  34-36
    4.1.2 方法  36
  4.2 结果  36-37
    4.2.1 SSCs解冻后的活率  36-37
    4.2.2 解冻后细胞的培养结果  37
  4.3 讨论  37
  4.4 小结  37-38
结论  38-39
参考文献  39-48
致谢  48-49
作者简介  49

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 >
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